[发明专利]一种基于焦磷酸测序的人类免疫缺陷病毒耐药性分析方法

说明书

本发明涉及基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV‑1的PR区和RT区耐药基因突变的方法和试剂盒。具体而言，本发明公开了检测PR区和RT区耐药基因突变的扩增引物和测序引物。本发明还涉及包含扩增引物和测序引物的用于焦磷酸测序技术检测HIV‑1耐药基因突变的试剂盒。本发明还涉及使用扩增引物和测序引物检测样品中的HIV‑1耐药基因突变的方法。

技术领域

本发明涉及基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1的PR区和RT区耐药基因突变的方法和试剂盒。具体而言，本发明公开了检测PR区和RT区耐药基因突变的扩增引物和测序引物。本发明还涉及包含扩增引物和测序引物的用于焦磷酸测序技术检测HIV-1耐药基因突变的试剂盒。本发明还涉及使用扩增引物和测序引物检测样品中的HIV-1耐药基因突变的方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是一种经血液传播引起获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，AIDS)的RNA病毒。HIV感染是全球性公共卫生问题之一，停止或扭转艾滋病蔓延是联合国千年发展目标之一。根据世界卫生组织(WHO)报告，截止2015年全球HIV感染者约有3670万人(3400-3980万人)，每年HIV感染相关死亡约110万人(94-130万人)，2015年新感染约210万人(150-240万人)。HIV可分为HIV-1和HIV-2两个亚型，其中HIV-1型高度变异，并在中国广泛流行。

随着艾滋病抗病毒治疗的标准化和扩大化，艾滋病服药依从性和治疗效果却并没有显著提高，HIV耐药出现是重要的困扰因素之一。患者体内的HIV病毒，常表现出基因多态性。耐药HIV病毒株产生因素主要包括：病毒的复制水平、复制能力和突变能力，宿主细胞中的病毒库，抗病毒药物选择作用等。HIV耐药导致治疗失败，治疗费用增加，病毒感染扩散风险增大，甚至导致感染死亡增多。因此，HIV耐药检测将有助于判断抗病毒治疗的效果，制定个体化的抗病毒治疗方案，进而更加有效地控制病毒的传播。

目前HIV耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。其中基因型检测的费用较低，技术也相对容易，因此具有广泛的临床应用前景。当前HIV耐药基因检测方法主要有以下几种：

(1)液态芯片法：该方法基于磁珠偶联的核酸杂交技术。每一个磁珠因具有两种荧光染料而具有唯一性和识别性，磁珠上偶联有24bp的寡核苷酸链。分别设计野生型和突变型的两条核酸探针，经过核酸杂交过程及荧光的激发过程，得到一定的荧光值。使用构建成功的质粒，分别优化核酸探针，建立检测体系。该方法优点是：实验检测自动化。该方法缺点是：操作复杂、价格昂贵、不能检测未知突变。

(2)基于Sanger测序(一代测序)技术的自建基因型耐药检测方法：该方法是目前国内主要采取的形式，其优点是：准确度高，是测序的金标准。主要的缺点是：一是无法对发生突变的病毒比例进行定量，二是检测时间较长，三是检测敏感度低。现在临床使用的一代测序用于HIV耐药基因的检测敏感性通常大于20％，我国达安公司注册的HIV耐药基因检测技术敏感性为40％。而根据文献报道，1％的突变就能因为药物治疗的选择作用导致突变病毒的快速增长，从而导致治疗失败。

(3)单基因组测序方法：单基因组测序通过将逆转录获得的cDNA稀释到每个反应体系1个拷贝，再分别扩增，能够最低检测出含量在1％的劣势突变。2005年，Palmer等人通过该方法证实艾滋病患者体内可存在常规方法无法检测到的耐药劣势株(通常在分子检测语境中，将检测到的含量在20％以下的耐药突变称为HIV-1的耐药劣势突变)。但该方法的缺点是：工作量非常大，可用于验证其他方法的精度，但无法作为常规检测使用。