[发明专利]一种改进的红色荧光蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种改进的红色荧光蛋白及其应用，属于蛋白质工程领域。本发明通过对来自奶嘴海葵红色荧光蛋白的eqFP578氨基酸序列的改造，获得一种改进的红色荧光蛋白RFPSpark，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，该蛋白与野生型具有明显不同的激发和发射光谱，具有荧光强度更强、成熟更快、稳定性更好和波长更长的特点，与另一个eqFP578的改造蛋白FP650相比，在同等测试条件下，本发明的红色荧光蛋白的荧光亮度比FP650高3倍。本发明还提供了改进的红色荧光蛋白的应用，适用于细胞标记、动物深组织和活体动物成像及多色应用等分析，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及一种改进的红色荧光蛋白及应用。

背景技术

荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像方面，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签的选择主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；4)可多通道检测，不相互干扰的荧光蛋白。针对动物体内成像，红色荧光蛋白是最好的选择，因为1)：红色荧光蛋白的激发和发射波长相对其他颜色的荧光蛋白更长，在动物体内的穿透性最强；2)：红光区的自发荧光和光吸收都很低，因此荧光背景最低，可以更清晰的显示红色荧光蛋白的荧光。

eqFP578是从奶嘴海葵Entacmaea quadricolor中分离出来的一种新型红色荧光蛋白，亮度约为DsRed2的1.5倍，为二聚体红色荧光蛋白，其激发和发射波长分别为552nm和578nm(Merzlyak E M.Nat Methods,2007,4(7):555～557)。但野生型eqFP578在使用上仍不是很理想，包括：1)：在成熟速度、荧光强度、波长等方面不适于厚标本和活体动物成像实验；2)：且在高浓度下易形成四聚体，对细胞或组织具有一定的毒性，其应用受到限制。3)：波长仍然偏短。因为在可见光谱的远红外部分，自体荧光和动物组织的光吸收都是最小，并且在远红外区的长波范围的光具有组织穿透力强、对动物组织损伤小、组织背景低、光漂白作用低等优点，更适用于深层组织器官的活体荧光成像。因此，远红荧光蛋白(Shaner NC.JCellSci.2007,120(Pt24):4247-4260)，即最大发射波长600nm的红色荧光蛋白，在活体荧光成像方面具有巨大的应用潜力。于是，荧光蛋白的改造慢慢向远红色偏移。

进一步优化红色荧光蛋白对于活体动物成像和厚样本检测非常重要，在野生型eqFP578红色荧光蛋白的基础上已有成功的优化的红色荧光蛋白。Merzlyak等采用随机突变的方法，对eqFP578进行突变，得到一个成熟时间短，亮度比DsRed2亮1.7倍的二聚体突变体，命名为TurboRFP(Merzlyak E M.Nat Methods,2007,4(7):555～557)。Shcherbo等对TurboRFP进行一系列定点和随机突变，获得二聚体红色荧光蛋白FP650，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其激发和发射波长分别为592nm和650nm，且具有很好的亮度和光稳定性(Shcherbo D,Nat Methods.2010Oct；7(10):827-9.)。进一步优化红色荧光蛋白的亮度对提高活体成像的质量尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光强度高、稳定性好、能用于动物深组织和活体影像的红色荧光蛋白及其应用。