[发明专利]一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法

说明书

本发明公开了一种血液乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(pregenome RNA，pgRNA)荧光定量PCR检测体系，以及利用该检测体系对HBV pgRNA进行检测的方法。所述检测体系包括正向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:1所示；反向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:2所示；带有随机锚定序列的逆转录引物，其核苷酸序列如SEQ NO:3所示；以及探针，其核苷酸序列如SEQ NO:4所示。采用本发明的检测体系和方法，可用于制备HBV诊断试剂或试剂盒。本发明排除了在检测过程中HBV DNA或其他RNA带来的可能干扰，确保了血液HBV pgRNA检测的特异性。

技术领域

本发明一般涉及乙型病毒性肝炎的诊断和治疗，以及感染病学、分子生物学、细胞生物学等领域。更具体地，本发明涉及一种血液中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)pgRNA的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染呈世界流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。我国属于HBV感染中高流行地区。2006年全国HBV血液流行病学调查显示，我国1～59岁一般人群中HBsAg携带率为7.18％。据此推算，我国慢性HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万例。在我国，慢性HBV感染与肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生密切相关。目前治疗慢乙肝的药物主要为干扰素和核苷(酸)类似物两类。两类药物均可高效抑制HBV复制，但由于肝细胞内共价闭合环状DNA(Covalentlyclosed circular DNA,cccDNA)的持续存在，使得目前慢乙肝治疗的临床治愈率很低(<5％)，停药后慢乙肝复发率较高，因此慢乙肝患者需要长期甚至终身服药。长期服药会给患者甚至社会带来极大的负担，并且在治疗过程中有可能会导致HBV耐药株的出现。基于此，目前迫切需要一种更加灵敏和精确的血液学指标，用于监测慢乙肝治疗的疗效和安全停药。

多篇文章已经证实血液中存在HBV RNA，具体的，HBV RNA可以存在于血清和/或血浆中，并且其水平与慢乙肝治疗的疗效和预后密切相关。然而，目前用于检测血液HBV RNA的荧光定量PCR方法的灵敏度和特异度均有待改善。发明人在前期研究中系统证实了血液中HBV RNA的存在形式和产生机制，其是存在于核衣壳内的HBV Pregenome RNA(pgRNA)在未经逆转录或不完全逆转录的情况下分泌至细胞外的。由此可见，血液中的HBV RNA实际上为pgRNA。定量检测血液HBV pgRNA的水平可更好地监测肝细胞内HBV cccDNA的水平，不失为一种良好的检测慢乙肝治疗疗效和安全停药的预测指标。开发定量检测血液中pgRNA的诊断试剂或试剂盒对于临床上慢乙肝的有效治疗和安全停药具有重要的指导意义。

发明内容

本发明一方面提供了一种血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系包括：正向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:1所示；反向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:2所示；以及反向锚定引物，其核苷酸序列如SEQ NO:3所示。

其中，正向引物SEQ NO:1为AGACCACCAAATGCCCCT；反向引物SEQ NO:2为(N)16-30。(N)16-30是指作为随机锚定序列的核苷酸序列，N可为A、T、C或G，且下角标处16-30表示碱基数目。反向锚定引物SEQ NO:3为(N)16-30-AGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA。SEQ NO:2和SEQNO:3中的(N)16-30表示相同的随机锚定序列。本领域技术人员知晓，虽然(N)16-30为随机序列，但为了保证扩增的效率，其应避免设计成为与HR-F或Probe-HR形成引物二聚体。此外，为了增加扩增的效率，在引物两端添加随机碱基后形成的引物序列也涵盖在本发明中。

在本发明的一些实施例中，血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系还包括探针，其核苷酸序列如SEQ NO:4所示。其中，探针SEQ NO:4为CAACACTTCCGGARACTACTGTTGTTAGACG。