[发明专利]一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法，具体涉及一种淮阴苜蓿蛋白沉淀、杂质分离和蛋白溶解，属于生物技术领域。

技术背景

蛋白质是细胞生理功能的执行者，了解淮阴苜蓿组织在不同阶段的蛋白质变化有助于分析造成淮阴苜蓿各个阶段生理功能差异的原因，而了解蛋白质的变化首先需要尽可能多地分离和分析其蛋白质，蛋白质的提取成为蛋白分析最为关键的步骤。一种理想的蛋白质分离方法，应尽可能多地分离到不同的蛋白质，并且对高丰度蛋白质要有一定的消除作用及对低丰度蛋白有一定的富集作用。由于植物组织样品富含色素、多酚、脂类、多糖等干扰性物质，这些物质可以与蛋白质、核酸等大分子物质形成复合物，因而较难获得纯净的蛋白质。三氯乙酸会导致溶液处于酸性环境，时间过长会导致蛋白的分解破坏，影响蛋白的完整性，因此，提取参数的调整对蛋白完整性起着重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法，本发明提取工艺简单，蛋白提取容易，制得的蛋白丰度均匀，蛋白破坏小。

本发明的技术方案是：

(1)研磨：取0.5-1g叶片，放入液氮预冷的研钵，研磨好的粉末转移到50mL离心管。

(2)沉淀：按1∶10的比例加入-20℃预冷含0.07％巯基乙醇、8-10％TCA的丙酮，混合充分后，-20℃放置30-50min，4℃，14000g离心15min，弃上清。

(3)清洗：沉淀加入-20℃预冷含0.07％巯基乙醇的90-100％丙酮溶液25mL，充分混合后，-20℃静置1h，4℃，14000g离心15min，弃上清，重复3次。

(4)转移：沉淀转移至1.5mL离心管中，4℃，14000g，5min，弃上清，室温干燥2h。

(5)溶解：沉淀按10μl/mg的比例加入裂解液，充分裂解2h后，15℃，16000g离心10min，将上清转移至新的离心管，上清液即为提取好的蛋白溶液。

所述的淮阴苜蓿蛋白的提取方法，各溶液成分为：三氯乙酸的丙酮中三氯乙酸的含量为10％；清洗液所用丙酮浓度为90％；裂解液成分为7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，1％DTT，2％Ampholytes。

本发明的创新之处在于，通过调整三氯乙酸含量、提取温度、提取时间、裂解液配方，实现了淮阴苜蓿不同丰度蛋白的提取。

具体实施方式

一种淮阴苜蓿蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)研磨：取0.5g叶片，放入液氮预冷的研钵，研磨好的粉末转移到50mL离心管。

(2)沉淀：按1∶10的比例加入-20℃预冷含0.07％巯基乙醇、8-10％TCA的丙酮，混合充分后，-20℃放置30～50min，4℃，14000g离心15min，弃上清。

(3)清洗：沉淀加入-20℃预冷含0.07％巯基乙醇的90-100％丙酮溶液25mL，充分混合后，-20℃静置1h，4℃，14000g离心15min，弃上清，重复3次。

(4)转移：沉淀转移至1.5mL离心管中，4℃，14000g，5min，弃上清，室温干燥2h。

(5)溶解：沉淀按10μl/mg的比例加入裂解液，充分裂解2h后，15℃，16000g离心10min，将上清转移至新的离心管，上清液即为提取好的蛋白溶液。

所述的淮阴苜蓿蛋白的提取方法，各溶液成分为：三氯乙酸的丙酮中三氯乙酸的含量为10％；清洗液所用丙酮浓度为90％；裂解液成分为7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，1％DTT，2％Ampholytes。

本发明通过在液氮中对样品进行研磨，有效的避免了研磨中高温对蛋白的破坏，蛋白质经过三氯乙酸丙酮充分沉淀并通过丙酮充分清洗，从而使蛋白质的提取更充分并减少了提取的蛋白质中的杂质含量，避免了使用价格昂贵的蛋白纯化试剂盒，提取时间短且操作简便、成本较低，节省了提取时间和提取成本。