[发明专利]一种肺癌miRNA标志物的联合检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种肺癌miRNA标志物的联合检测试剂盒。

背景技术

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，目前在全世界的发病率和死亡率都高居其它恶性肿瘤之首。2015年在美国，大约有86380名男性和86380名女性死于肺癌。2015年在中国，肺癌的发病率和死亡率分别为0.0733％和0.061％，在癌症相关疾病中排名第一。由于早期肺癌患者的症状不明显，大多数病人确诊时已处于中晚期阶段，因此在肺癌的预防和治疗中，提高肺癌的早期诊断起着至关重要的作用。目前肺癌的早期诊断主要依赖影像技术和肿瘤标志物的检测。低剂量计算机断层扫描(LDCT)具有较高的灵敏度，是最常见的肺癌筛查和诊断手段。但CT假阳性较高、检测费用高，并且辐射对人体还有潜在的伤害。血清肿瘤标志物的检测因其安全无害，费用低且简单可行，在早期肺癌的筛查和诊断中具有重要的作用。

微小RNA(miRNA)是一类高度保守、内源性、非编码的单链小分子RNA,其长度约为19～25nt，主要参与基因转录和转录后水平的调控,可调节不同的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、黏附和死亡等，与癌症的形成和演变密切相关。miRNA会因为细胞的死亡或者细胞主动分泌进入到血液循环中，其作为肿瘤标志物检测具备以下优点：在癌症细胞中miRNA会异常表达，miRNA在血浆或血清中很稳定，因此可以通过实时定量PCR进行检测。miRNA在癌症疾病过程中可能发挥着促癌或抑癌基因的作用。大量研究表明，miRNA可以有效用于肺癌的早期诊断。

发明内容

为了解决上述问题，首次提供了mir-141和mir-193b联合检测用于肺癌筛查的试剂盒和检测方法。

本发明首先提供了一种肺癌的筛查试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～2所示逆转录引物，以及SEQ ID NO.3～4和SEQ ID NO.5～4所示引物对。

其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO.6所示逆转录引物，以及SEQ ID NO.7～8所示引物对。

本发明还提供了SEQ ID NO.1～2所示逆转录引物，以及SEQ ID NO.3～4和SEQ ID NO.5～4所示引物对在制备肺癌筛查用试剂中的用途。

其中，所述试剂还包括SEQ ID NO.6所示逆转录引物，以及SEQ ID NO.7～8所示引物对。

本发明还提供了一种肺癌的筛查方法，它包括如下步骤：

a，提取样本RNA：提取待检样本中的RNA；

b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的RNA进行逆转录和DNA扩增；

c，结果检测：对扩增结果进行检测。

步骤a所述的样本为肺组织。

本发明选择联合检测了mir-141、mir-193b，并以U6为检测内参，通过设计茎环法逆转录引物，反复优化反应体系和条件，实现了用一份RNA同时完成以上两个miRNA和U6基因的混合逆转，用荧光定量PCR检测这两个miRNA指标后能显著区分肺癌组织和正常组织，并且通过测序验证，表明所得PCR产物均为特异性扩增，结果可靠。同时，本发明方法和试剂盒的检测灵敏度高，特异性好，可用于指征肺癌的发生发展，辅助临床早期肺癌的筛查，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1荧光定量PCR溶解曲线

图2荧光定量PCR产物电泳鉴定

图3测序鉴定结果

图4不同组织的mir141以及mir193b的表达水平，A肺癌远端组织、C肺癌组织、F肺癌旁组织。

具体实施方式

实施例1本发明检测方法

一、实验方法

1材料

1.1样本

待测组织样本取自四川大学华西医院呼吸科收治病人，其中肺癌组织10个，肺癌远端正常组织10个，癌旁组织10个，已通过病理学确诊。

1.2主要仪器与试剂