[发明专利]一种胞外囊泡/脂质体的定量方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及纳米材料领域，特别涉及一种胞外囊泡/脂质体的定量方法。

背景技术

外泌体是一种细胞分泌的具有脂质双分子层结构的纳米囊泡，粒径分布为30-100nm，在细胞间的相互通讯中有十分重要的作用，可作为生物标记物用于疾病的筛查和诊断。不同细胞或细胞在不同的应激条件下分泌的外泌体数目存在显著差异，因此细胞分泌的外泌体的数目是一项重要的生理、病理参数。因此对外泌体进行精确地定量分析在临床和科研领域都具有十分重要的意义。但是由于外泌体的粒径太小，对其精确定量一直都面临很大技术困难。

目前常用的定量手段有蛋白定量法、纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术、动态光散射(DLS)技术、qnano定量技术、流式细胞仪。

蛋白定量法是指通过BCA法等蛋白定量方法对外泌体所含蛋白作相对定量分析间接表征外泌体的数量。因为这是一种间接的相对定量方法，其对外泌体的定量分析精度不高。

纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术，使用激光照射悬浮液中的颗粒，并用视频摄像机捕获所产生的散射光成像，进而跟踪单个颗粒的布朗运动，得到颗粒的浓度，从而实现对颗粒的精确计数。但要实现对单个颗粒的追踪需要灵敏的成像系统，成本高。而且反应或团聚引起的尺寸改变、蛋白聚集体都会影响测量结果，因此样品需要彻底纯化。

动态光散射(DLS)技术是使用激光照射悬浮液中的颗粒，测定不同时间整个样品散射强度的变化，根据散射强度与粒子浓度存在相关性，基于系列的假设，将散射强度分布转换成数目分布。但因为DLS得到的初始信息是散射强度分布，需要基于系列的假设，才能将散射强度分布转换成数目分布。这一系列的假设和转换会引入较大误差，而且一些反应或团聚导致的粒子尺寸改变、蛋白聚集体也会影响散射强度，从而使得到的粒子数目不准确。

qnano：在电压或压力的驱动下，带电离子以电泳的形式通过纳米孔，形成离子电流，当待测的带电粒子迁移通过纳米孔时会引起可测的离子电流降低。根据纳米孔尺寸和电流变化次数可以得到粒子的粒径分布和粒子数目。但纳米颗粒与纳米孔膜之间存在非特异性吸附，计数不准确。反应或团聚引起的尺寸改变、蛋白聚集体都会影响测量结果，因此样品需要彻底纯化。而且还需要灵敏的检测离子电流变化的传感器和尺寸可控的纳米孔膜，成本高。

流式细胞仪：通常，商用流式细胞仪的实际粒度下限约为300nm，而胞外囊泡或外泌体粒径普遍在该数值之下，信号无法与基线噪音区分开来。因此需要适用小粒径的特种的流式设备，如Apogee Flow Systems。但这种特殊的流式设备，价格昂贵，成本高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一胞外囊泡/脂质体的定量方法。所述的计数方法可以实现绝对定量，成本低廉。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明的胞外囊泡/脂质体的定量方法包含如下步骤：

1)将锚定分子与核酸连结；

2)将连接后的锚定分子-核酸复合物与胞外囊泡/脂质体共孵育，将该复合物锚定到胞外囊泡/脂质体上；

3)过滤掉多余的未与胞外囊泡/脂质体连结的锚定分子-核酸复合物；

4)将连结有锚定分子-核酸复合物的胞外囊泡/脂质体与核酸扩增混合液混合后进行扩增反应，定量。

本发明所述的胞外囊泡包括外泌体和囊泡。

优选的，步骤1)所述的锚定分子为非特异性锚定分子或特异性锚定分子，非特异性锚定分子包括但不限于硬脂酰(stearyl)，胆固醇(cholesterol)，糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol)，油烯基链(oleyl chain)及其衍生物，优选PEG修饰的油烯基链；特异性锚定分子包括但不限于抗体、核酸适配体，优选为核酸适配体。

当锚定分子为核酸适配体时；核酸适配体作为锚定分子-核酸复合物直接与胞外囊泡/脂质体共孵育，无需再与核酸连结。

步骤1)所述的核酸为单、双链的DNA或RNA，长度10Kb-200Kb；优选为双链的DNA，20Kb-50Kb；所述将锚定分子与核酸连结是指通过锚定分子与核酸上基团间的化学反应将二者连结在一起，优选为经过羧基或氨基修饰的锚定分子与氨基或羧基修饰的核酸分子通过氨基与羧基间的缩合反应连结在一起。

步骤2)所述的共孵育是指将锚定分子-核酸复合物与胞外囊泡/脂质体混合后，在10℃—80℃下孵育5min-24h时间，优选为30℃-50℃，孵育10min-1h。