[发明专利]检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种用于检测血清4型禽腺病毒(FAdV-4)抗体的间接ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)。该病毒粒子无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体对称，由衣壳、纤突、核酸芯髓及相关蛋白构成。根据群特异性抗原的不同，禽腺病毒可分为3群(I-III群)。其中I群禽腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅及其它禽类分离获得的腺病毒，其包含5个基因型(A-E)、12个血清型(1-11，8a，8b)。在FAdV的编码蛋白中，F2纤突蛋白(fiber-2)的氨基酸组成不保守，表面带有亚群及型的特异性抗原表位；同时，fiber-2蛋白可识别宿主细胞上的特异性受体，使病毒能够吸附于宿主细胞，这一功能与病毒的感染能力、组织嗜性及毒力密切相关。

FAdV可经粪便、气管和鼻腔粘膜水平传播，也可垂直传播，主要为种鸡产蛋期感染后1～2周内经蛋传播给子代。鸡群感染后表现为包含体肝炎和心包积液的临床症状，引起死亡率在10％-80％之间，其中肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome)也称“安卡拉”病是由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起，也是致病性最强的一个血清型。近年来国内报道FAdV-4感染有增多的趋势，给国内养禽业造成巨大经济损失。

FAdV-4的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定，琼脂扩散试验，酶联免疫吸附试验等，病毒的分离与鉴定结果准确可信，但是检测周期长，操作繁琐，不利于疾病的快速诊断。

目前国内市场上仅有的针对I群FAdV的通用抗体检测的商品化ELISA试剂盒，由于是国外进口产品，价格昂贵，并且不能用于血清4型FAdV抗体的特异性检测和FAdV-4疫苗免疫效果的评价。因此急需研发出针对血清4型FAdV的ELISA抗体检测试剂盒。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其具有操作简单、高特异性、高灵敏度、低成本的特点。

本发明的另一目的在于提供一种通过所述间接ELISA试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的方法，从而可以更简便、快捷、准确地检测血清4型禽腺病毒抗体。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括：ELISA反应板，重组FAdV-4fiber-2蛋白，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体，包被液，封闭液，洗涤液，底物显色液，和终止液。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述重组FAdV-4fiber-2蛋白是通过如下步骤获得的：

原核表达：以NCBI数据库中血清4型FAdV JSJ13株(GenBank登录号为KM096544)基因组序列作为参考，设计特异性引物，扩增FAdV-4JSJ13株fiber-2基因完整的开放阅读框，将其克隆至pET-32a原核表达载体，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中通过加入0.4-0.8mM IPTG诱导重组蛋白进行表达；

蛋白纯化和复性：将重组菌株超声处理后，提取菌体沉淀进行亲和层析纯化，进而通过梯度透析法复性，获得可溶性FAdV-4fiber-2蛋白；

蛋白鉴定：利用Western blotting方法对纯化后的FAdV-4fiber-2蛋白进行鉴定。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，所述FAdV-4fiber-2蛋白的基因序列扩增引物如下：

上游引物：5’-CCGGATATCATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG-3’，插入EcoR V酶切位点；

下游引物：5’-CCGAAGCTTTTACGGGAGGGAGGCCGCTGG-3’，插入Hind III酶切位点。

上述检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在另一种实施方式中，

所述包被液为碳酸盐缓冲液，其通过称取NACO₃ 1.5g及NaHCO₃2.9g，加入900mL超纯水溶解后，定容至1000mL获得；