[发明专利]一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；发明人通过设计简并引物来扩增SnATCN基因的保守区域,然后再通过RACE‑PCR的方法从龙葵cDNA中扩增得到SnATCN基因的全长DNA序列；同时发现龙葵果实不同发育阶段花青素含量变化和SnATCN基因表达量变化成正相关关系，最后将SnATCN基因在烟草中进行瞬时表达，证实其能够激活烟草中花青素的合成，最终验证SnATCN基因对于花青素合成的正调控功能。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用。

背景技术

花青素作为一种广泛存在于植物中的水溶性色素，属于类黄酮类物质，存在于27个科的72个属的开花植物中(Sarma et al.,1997)。作为一种天然色素,花青素是水溶性的并能赋予许多鲜花和水果紫色、蓝色和红色等颜色,并能促进传粉和种子分散(Shang etal.,2011)。许多研究证实,天然花青素能保护植物免受一些生物和非生物胁迫(Ballaréetal.,2003)。另外，富含花青素的饮食对于人类健康具有明显的保健功能。花青素具有治疗某些慢性疾病例如高血糖和抑制肿瘤细胞生长的作用，以及提高视力的作用。

目前，影响植物花青素合成的基因主要分为结构基因和调控基因两大类。其中结构基因是直接编码花青素合成途径中的关键酶基因，主要包括CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UF3GT等。这些结构基因参与了花青素合成的不同阶段，其中CHS、CHI、F3H等属于早期结构基因，而DFR、ANS、UF3GT等属于晚期合成结构基因。而调控基因是编码转录因子的，它们能够参与调控以上结构基因的时空表达(Holton et al.,2015)。转录因子主要是一些MBW(MYB-bHLH-WD40)复合物，其中MYB转录因子能够直接结合花青素合成上游相关结构基因(PAL、C4H、CHI等)的启动子区，调控其表达(Zhang et al.,2015)。bHLH则能够与MYB互作有利于其形成的复合物激活花青素下游一些结构基因(DFR、ANS、UF3GT等)的启动子并进行表达(Xu et al.,2015)。而WD40蛋白能够通过结合bHLH来维持MBW复合物的稳定性。例如，拟南芥中的AtPAP1/PAP2(MYB)、AtTTG1(WD40)以及AtTT8/GL3/EGL3(bHLH)共同调控花青素结构基因表达，从而影响拟南芥中花青素的合成(Hichri et al.,2011)。

龙葵因具有多种生物活性被作为一种传统的中药植物广泛种植，其具有繁殖快速，结实率高的特点。其植株提取物具有消炎，抗菌，抑制肿瘤生长等作用。龙葵中虽然含有丰富的花青素(Huang et al.,2010)，但是目前还没有研究对龙葵中花青素的合成调控机制，及其相关基因的克隆和功能验证进行相关报道。因此，根据下述原因，对龙葵中花青素合成调控基因的克隆及功能验证具有重大应用价值：(1)Huang(2010)等在通过酸化处理龙葵果实0.5h后检测其中花青素含量达到了1.28mg/g，而Gavrilova(2011)等检测了作为花青素重要提取来源的蓝莓及黑加仑中的花青素含量，由于品种不同其含量仅为0.41-0.83mg/g以及0.14-1.8m g/g不等。这也暗示高花青素含量的龙葵果实可作为重要的花青素提取来源；(2)作为花青素重要的潜在提取来源，了解龙葵中花青素的合成调控机制，发掘新的花青素合成相关基因，为利用这些相关基因资源培育高花青素品种植株提供重要理论参考价值。

分离克隆花青素合成调控基因是对龙葵中花青素合成机理研究的前提，但是由于龙葵基因组测序工作还未完成，其基因序列未知，使得从其中克隆分离基因会有一定难度，也因此很少有研究对于龙葵中花青素相关调控基因的克隆及功能分析进行研究报道。因此，寻找一种龙葵花青素合成调控基因，以及其简便可靠的基因克隆方法，以及功能验证方法对于从龙葵中克隆花青素合成调控基因及其功能验证是亟待解决的问题之一，该问题的解决将会为后来发掘这些花青素合成调控基因以及利用其作为基因操控对象培育高花青素含量株系提供重要应用价值。