[发明专利]用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及医疗检测领域，更具体的说是涉及一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒及其使用方法。

背景技术

近年来，随着生物、医学、法医学等各相关领域的发展，荧光PCR技术得到了越来越广泛的应用。血液作为一种重要的生物分析样本，其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血液中含有血红素、杂蛋白、脂肪等。因此，基于现有技术，无法实现荧光PCR方法直接对血液中的核酸进行扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。一般包括以下三个过程：一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增失败的可能。此外，由于提取过程耗时长，成本高，且需借助苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。

科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克和天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。

科学研究已经证实，与甲基类维生素(叶酸及维生素B12)代谢密切相关的基因是MTHFR。MTHFR编码蛋白5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，其基因变异会引起相应的酶活性降低，阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。

MTHFR全称5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶)，位于一号染色体lp36.3位置。MTHFE全长19.3kb，mRNA全长7105bp，共有外显子12个，编码共有657个氨基酸编码子的蛋白。亚甲基四氢叶酸还原酶催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。

目前针对基因多态性的检测方法最常见方法为测序法，该方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在一定的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩增效率高、成本低的一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，旨在解决现有技术对血液进行荧光定量PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题，并快速得到MTHFR的SNP分型指导叶酸用药。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于血液直接检测叶酸用药敏感型基因的试剂盒，所述试剂盒含有下列组分：血液高耐受taq聚合酶、血液高耐受taq聚合酶专用buffer、血液样本、引物对、探针对、dNTPs、双蒸水；

所述引物为MTHFRC677T引物和MTHFRA1298C引物，

所述MTHFRC677T引物包括：

正向引物：MTHFRC677T-F：5’-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3’；

反向引物：MTHFRC677T-R：5’-TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT-3’；

所述MTHFRA1298C引物包括：

正向引物：MTHFRA1298C-F：5’-GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3’；

反向引物：MTHFRA1298C-R：5’-CCCGAGAGGTAAAGAACAAAGACTT-3’；

所述探针为MTHFRC677T探针和MTHFRA1298C探针

MTHFRC677T探针包括：

MTHFRC677T野生型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGGCTCCCGC-MGB-3’；

MTHFRC677T突变型探针：5’-荧光基团-ATGAAATCGACTCCCGC-MGB-3’；

所述MTHFRA1298C探针包括：