[发明专利]利用mRNA表达谱与circRNA表达谱联合筛选脊髓损伤时间基因的方法

权利要求书

1.一种利用mRNA表达谱与circRNA表达谱联合筛选脊髓损伤时间基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、通过mRNA和circRNA表达谱芯片检测基因的表达值，采用过滤式特征基因选择方法对检测到的基因的相关性进行排序，去除低相关度基因，留下与脊髓损伤组和正常组密切相关的特征基因；

步骤2、将采用过滤式特征基因选择方法获取的mRNA和circRNA特征基因进行合并，形成基因池U；

步骤3、通过遗传算法，对基因池U进一步选择基因，消除冗余基因，搜索获得一个最优特征的最优基因集S，使其具有最少的基因数量和更好的分类性能；

步骤4、通过比较不同时间脊髓损伤组和正常组的mRNA与circRNA联合表达谱的不同、样本间的数据从而选出差异表达的基因；基于差异表达的基因，进行差异基因表达模式聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析以及蛋白互作网络分析；

步骤5、对差异表达基因预测，挑选score值大于140，自由能小于-20的作为可靠的靶基因；再从靶基因中挑选有显著差异的，用剩余部分RNA对构建的脊髓损伤组和正常组发病时间目的靶基因进行验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中：采用过滤式特征基因选择方法的选择实施为：分别去除mRNA和circRNA表达谱芯片中的1000～2000个低相关度基因，留下100～200个与脊髓损伤组和正常组密切相关的基因，分别在mRNA和circRNA表达谱中选取得分最高的1～50个特征基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述最优基因集S的基因数量为1～10个。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述mRNA表达谱与circRNA表达谱的获取步骤如下：

(1)、实验动物及分组；

对于体重20-25g，SPF级别ICR小鼠，给予充足的无菌水及饲料，白天给予日常光亮，晚上给予黑暗环境，实验前一周建立适宜的昼夜环境，每日早上予以更换垫料、饲料和水；

实验动物15只，分为2组：正常组、脊髓损伤组；按照脊髓损伤后取出脊髓组织时间分为1天、3天、7天及21天；

(2)、制造小鼠脊髓损伤模型；

取ICR小鼠于实验动物操作台，按照35mg/kg注射量将0.35％戊巴比妥钠经腹腔麦氏点注射麻醉，待夹皮反射及瞳孔反射消失后，用眼科剪剪去背部毛发，碘伏消毒背部皮肤，常规铺双层无菌手术单，常规洗手带无菌手套，背部中线最高点第10胸椎为中点，上下各2cm作为手术切口，切开皮肤暴露椎旁肌肉，钝性分离椎旁肌肉，适当剪去两边张力较大处肌肉，暴露第10椎板，特制血管钳去除棘突，显微器械剪去棘间韧带，打开椎板，暴露脊髓，将小鼠放置于MASCIS撞机仪工作台，撞机仪两旁手臂分别固定第9及第11脊柱后，装备10g撞击棒，自2.5cm处自由落体撞击第10椎体层面脊髓中央，小鼠双下肢出现强制性抽搐，尾巴甩向一侧后，出现双下肢瘫痪，造成小鼠脊髓损伤模型；

(3)、脊髓损伤后小鼠处理；

脊髓损伤后小鼠出现双下肢瘫痪，排尿反射消失，易出现感染致死，每日早晚按摩膀胱，辅助小鼠进行排便，每日2次肌肉注射青霉素2万单位；脊髓损伤后小鼠进行分笼饲养，每笼3只，随机分为脊髓损伤后1天、3天、7天、21天和正常组；分别按损伤后时间1天、3天、7天及21天断颈法处死小鼠；以损伤后脊髓中心为中点，上下各5mm，用DEPC水处理过的手术器械剥离取出损伤后的脊髓，放置在DEPC处理过的PBS溶液内，分装到eppendorf管中，放置于液氮中；

(4)、提取样本中的总RNA；

(5)、总RNA质检；

分别用不同的红、绿荧光基团标记，芯片杂交，经过洗脱后，荧光扫描，通过图像分析软件，获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度Cy5和Cy3，进而获得Cy5和Cy3的比值；

(6)获得mRNA基因表达谱；

(7)重复上述步骤(1)～(5)，获得circRNA基因表达谱。