[发明专利]一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种核苷酸片段，其特征在于，为博落回防御素编码基因，用于编码博落回防御素功能蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组博落回防御素，其特征在于，包括博落回防御素功能蛋白McDef1和/或McDef2，所述博落回防御素功能蛋白McDef1、McDef2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示，编码McDef1、McDef2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌为含如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的酿酒酵母表达载体pVT102U/α的酿酒酵母。

4.一种重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建含如权利要求1所述的博落回防御素编码基因的重组表达载体；

2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；

3）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得如权利要求2所述的博落回防御素功能蛋白。

5.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。

6.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中构建重组菌的具体操作为：取重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA 1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌悬液，20 μL；PEG 溶液1.5 mL 加入10 mL 无菌管中，混合，30℃，200 rpm，培养30 min；42℃热击15 min 后，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200 μL 1×TE 洗涤，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200 μL 1×TE 溶液中；细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养4-6天。

7.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mLYSD液体培养基中， 30℃，250rpm，培养12h；按1:25的比例将制备的种子液接种入50mLYSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；再按1:25的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养72h。

8.如权利要求4~7任一项所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述重组博落回防御素的制备方法还包括：

4）蛋白纯化：收集步骤3）发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化，

所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M NH4AC平衡过的DEAE凝胶混合，室温放置0.5 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH 值调至4.2 后直接上预先用0.1M CH3COONa平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱，然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步脱盐反相纯化，低温冻干。

9.一种博落回防御素重组菌的发酵产物，其特征在于，采用如权利要求4~8所述重组博落回防御素的制备方法制得。

10.一种重组博落回防御素的应用，其特征在于，如权利要求2所述的博落回防御素功能蛋白或者如权利要求9所述的发酵产物在抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。