[发明专利]一种提取I型胶原蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，具体为一种提取I型胶原蛋白的方法。

背景技术

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%~30%。胶原蛋白是结缔组织普遍存在的成分，是器官和组织必不可少的构造骨架，目前已经发现27种以上不同类型的胶原蛋白。I型胶原蛋白广泛存在于动物的骨、角膜、皮肤、肌腱等组织中，分子量约300KD，其分子长度约为300nm，直径约1.5nm，呈棒状。显微结构上I型胶原蛋白由三条肽链组成，包括两条α(I)链和一条α(II)链。由于I型胶原蛋白具有可降解性、生物相容性和止血性等许多优良的生物学特性，因此被作为天然生物材料广泛应用于生物医学和组织工程学领域。

目前市场上出售的I型胶原蛋白主要从动物皮和跟腱组织中提取制备而成，由于现有的提取方法制备出的I型胶原蛋白受工艺条件的影响，提取产率较低，而且提取的胶原蛋白中含有的杂蛋白较多，严重影响胶原蛋白的质量，而在生物医学和化妆品行业等领域的广泛应用I型胶原蛋白的需求量与日俱增，因此，因此设计一种I型胶原蛋白提取方法以提高胶原蛋白的提取产率来满足I型胶原蛋白在在生物医学和化妆品行业等领域的应用显得十分必要。

本发明以动物跟腱组织为原料，采用酸性酶法技术制备出一种I型胶原蛋白。该方法不仅可以提高I型胶原蛋白的提取产率，而且提取的I型胶原蛋白的杂蛋白含量较低。本发明提取的I型胶原蛋白具有优良的生物相容性和生物活性，能够适应生物医学的应用，同时能够活化上皮细胞，促进上皮细胞增生和胶原酶生成，使皮肤紧致有弹力，在化妆品领域具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种提取I型胶原蛋白海绵的方法， 该制备工艺简单，能够提高I型胶原蛋白的提取产率，而且提取的I型胶原蛋白的杂蛋白含量较低。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。

本发明以动物跟腱组织为原料，采用酸性酶法技术制备出一种I型胶原蛋白，其提取过程包括以下七个步骤：（1）将牛跟腱洗净后冷冻切片；（2）配置溶液将跟腱切片消毒脱脂；（3）将跟腱切片在碳酸钠溶液浸泡脱去杂蛋白后水洗至中性；（4）采用匀浆机对跟腱切片进行均将破碎；（5）向匀浆液中加入胃蛋白酶，15~25℃下搅拌消化；（6）将上清液进行盐析处理，再将沉淀溶解后进行透析处理；（7）将透析后的胶原原液进行冷冻干燥即得I型胶原蛋白，取出后真空封装。

实施的具体技术方案如下。

步骤一：清洗工艺

将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。

步骤二：消毒脱脂工艺

称取100g跟腱片置于消毒脱脂溶液中浸泡，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次。

步骤三：脱杂蛋白工艺

将消毒脱脂后的跟腱片用碱性溶液浸泡进行脱杂蛋白，机械搅拌，间隔6~8h更换一次碱性溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次至跟腱片表面为中性（pH值为7）。

步骤四：破碎工艺

将脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，并将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的酸性溶液中，采用匀浆机对其匀浆破碎若干次，每次匀浆5min。

步骤五：酶解消化工艺

将匀浆液置于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL酸性溶液，再向其中加入适量的活性酶，搅拌消化，离心15~30min。取上清液备用。

步骤六：盐析透析工艺

使用氢氧化钠溶液将上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠进行搅拌盐析，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀若干次，沥干。将沥干的沉淀溶解于透析液中进行透析。

步骤七：干燥工艺

将透析后的胶原原液在-50℃进行干燥处理，取出后真空封装。

所述的一种提取I型胶原蛋白的方法所有步骤所使用的溶液及超纯水温度均为15~25℃。

所述的一种提取I型胶原蛋白的方法步骤二中的消毒脱脂溶液为75%酒精和正己烷的混合溶液，75%乙醇与正己烷的体积比为1:1~5:1，优选75%乙醇：正己烷=3:1；消毒脱脂时间为6~24h，优选时间为12h。