[发明专利]一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

伽马氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物体中，研究发现，伽马氨基丁酸具有改善心血管，治疗神经疾病，改善肝肾功能和调节内分泌系统等重要作用，因此它在药物治疗和功能性食品方面具有广阔的应用前景。

制备伽马氨基丁酸的方法主要有化学法、动植物富集法和微生物合成法三大类方法。化学合成法在生产中使用了有毒的化学试剂，生产得到的伽马氨基丁酸不能添加到食品中；而伽马氨基丁酸在动植物中含量很低，通过植物富集法来得到伽马氨基丁酸面临着成本过高的问题；微生物合成法是指利用微生物细胞内含有的谷氨酸脱羧酶生物催化L-谷氨酸钠(L-MSG)发生脱羧反应制备伽马氨基丁酸。

采用乳酸菌等野生菌发酵生产伽马氨基丁酸面临着培养周期长、产酶效率低、分离提纯步骤复杂等缺点；用大肠杆菌表达外源谷氨酸脱羧酶虽然酶活能大大提高，但由于大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在发酵过程中会产生内毒素，所以利用大肠杆菌为生产菌株生产伽马氨基丁酸不能用于食品工业。枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵食品的历史，被美国FDA和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株，它具有培养简单快速、蛋白分泌能力强、表达的蛋白不易形成包涵体、非致病性等特点，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。

发明内容

本发明提供一株表达谷氨酸脱羧酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化谷氨酸钠制备伽马氨基丁酸，对生产食品级的伽马氨基丁酸具有重要的意义。

本发明的技术方案如下：

一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK44.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016774，其为将重组质粒pUB-HpaII-P43-gad-dal导入宿主细胞WB600(dal^-)而得到的，其组成为WB600/pUB-HpaII-P43-gad-dal，其能够合成氨基酸序列SEQ ID No.1的谷氨酸脱羧酶。

一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的谷氨酸脱羧酶的编码基因是以来源于密码子优化后的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403的gad基因克隆得到的，原始gad核酸序列如SEQ ID No.2所示，优化后的gad核酸序列如SEQ ID No.3所示

一种载体质粒pUB-HpaII-P43-dal，其核酸序列为SEQ ID No.4。

一种重组质粒pUB-HpaII-P43-gad-dal，包含了所述优化后的gad核酸序列SEQ ID No.3和pUB-HpaII-P43-dal中核酸序列SEQ ID No.4。

所述的表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括将来源于密码子优化后的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403的gad基因序列(其优化后的核酸序列如SEQ ID No.3)和双启动子表达载体pUB-HpaII-P43-dal(其核酸序列如SEQ ID No.4)通过PCR方式融合得到质粒pUB-HpaII-P43-gad-dal；并将质粒转化到含D-丙氨酸缺陷型筛选标记的枯草芽孢杆菌WB600(dal^-)中表达，获得一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌WB600/pUB-HpaII-P43-gad-dal，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK 44.001，保藏编号CCTCC NO：M 2016774。

具体步骤为：

（1）宿主细胞WB600(dal^-)的构建：WB600(dal^-)是D-丙氨酸消旋酶基因缺陷的枯草芽孢杆菌，