[发明专利]用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法

说明书

一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法，包括芯片载体，该芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针；包括待测样品DNA提取、样品PCR扩增、PCR产物与芯片杂交、芯片杂交后的处理、杂交芯片的扫描及结果判读的步骤。优点是：针对每种弧菌变异区序列设计的特异性探针，显著提高了检测的特异性。本发明提高了鉴定参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的能力，同时极大地缩短了检测时间。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，特别涉及用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法。

背景技术

随着人工养殖迅速发展，养殖水域生态变化，弧菌病已经成为海水养殖动物主要的细菌性病害之一。在世界各地养殖参虾贝水产动物中，由弧菌属(Vibrio)细菌引起的弧菌病(Vibriosis)是普遍流行且危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。研究表明，弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和灿烂弧菌在弧菌种群中占优势，广泛存在于自然海水中，导致弧菌病发生，且具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，给参虾贝等海水动物的养殖造成了巨大的影响。因此，急需一种检测速度快、准确性高、特异性强的参虾贝养殖区致病弧菌的检测方法。

目前，海洋微生物检测方法一般为生化检测法，但该方法存在培养周期长，操作繁琐，特异性差等缺点。同时，由于自然环境中仅有小于1％左右的微生物为可培养，而基因芯片不需要活的细菌，只需有DNA即可。现有基因芯片设计的探针多是针对16S rRNA基因，而16S rDNA用于致病弧菌的检测比较保守，由于信息位点较少，因此构建的系统稳定性较差，用于鉴定亲缘关系较接近的细菌，容易产生偏差，引起假阳性，影响检测结果的准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可并行性的快速、高效、准确的检测参虾贝养殖区环境及生物体六种致病弧菌群的基因芯片和使用方法。

本发明的技术方案是：

一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特殊之处在于：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostable direct hemolysin和multidrug resistance protein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipid transfer protein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl-accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putativepermeases of the drug/metabolite transporter为靶基因。各探针的基因序列如下：

进一步的，所述化学修饰为氨基修饰。

一种用于检测参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群基因芯片的使用方法，包括待测样品DNA提取步骤；样品PCR扩增步骤；PCR产物与芯片杂交步骤；芯片杂交后的处理步骤；杂交芯片的扫描及结果判读的步骤，其特殊之处在于：所述的样品PCR扩增步骤中针对致病弧菌群不同菌种靶基因所设计的PCR扩增的引物序列如下：

所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：PCR Mix 12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA 1μL；ddH₂O 10.3μL；扩增程序为：①95℃5min；②95℃30s；③61℃或55℃30s；④72℃45s，返回到②35个循环；⑤72℃10min；⑥4℃保存。