[发明专利]一种杠柳苷元的生物转化制备方法

说明书

本发明公开了一种杠柳苷元的生物转化制备方法，所述方法是以黑曲霉HC306发酵培养获得的发酵液经抽滤后的滤液为催化剂，以香加皮为原料构成转化体系，在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液过滤，滤饼干燥后分离纯化，获得杠柳苷元。本发明方法发酵培养基成分简单，发酵成本低；黑曲霉HC306生长迅速、抗杂菌污染能力强、容易培养，批次稳定；以香加皮干粉为原料，投入黑曲霉HC306粗酶体系转化，既免去杠柳毒苷分离提取操作，也免去了酶的分离纯化步骤，工艺简单，易于工业化应用；杠柳苷元含量最高可达7mg/g以上，是提取杠柳苷元的较佳原料。

(一)技术领域

本发明涉及一种利用微生物酶生物转化法制备杠柳苷元的方法。

(二)背景技术

杠柳苷元(periplogenin)是一种存在于中药材香加皮(Periplocae Cortex)中的强心苷(CAS号为514-39-6，化学结构式见图1)，有强心、抗炎和抗肿瘤等药理作用，对体外培养的多种肿瘤细胞，如对小鼠S180肉瘤细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肺癌A549细胞和人肝癌HepG2细胞等肿瘤细胞株均具有毒性作用[韩宇博，赵爱国.杠柳苷元的抗肿瘤作用研究.中国小儿血液与肿瘤杂志，2008,13(1):1-5]；杠柳苷元对人皮肤异常增殖细胞的增殖具有抑制作用，而且对心得安诱导的豚鼠银屑病模型具有较好的治疗作用，但对皮下结缔组织细胞A9则无抑制作用，因而可以治疗皮肤增生性疾病[鲍永利，李玉新，张文静，等.一种杠柳苷元及其衍生物用于防治皮肤增生性疾病的应用：中国，201510811907.0，2016-02-24]。杠柳苷元对体外培养的肥大细胞、致敏大鼠肥大细胞的组胺释放有显著的抑制作用，口服给药杠柳苷元可使小鼠显著减少肥大细胞的组胺释放，具有显著的抗炎作用[顾卫，赵力建，赵爱国.杠柳苷元对肥大细胞脱颗粒及释放组胺影响的研究.中国药房，2008,19(3):166-168]。由此可见，杠柳苷元作为药物应用于临床疾病治疗的前景广阔。

杠柳苷元天然存在于香加皮中，但含量极低，几乎不可能用天然提取法生产杠柳苷元，目前尚未见化学合成法的研究报道。在香加皮中，杠柳苷元的糖苷—杠柳毒苷(periplocin，CAS号13137-64-9，化学结构式见图1)的含量却较高。不同产地的香加皮中，杠柳毒苷的含量差别较大，在0.060～12.15mg/g之间，其中以产自天津蓟县的香加皮中杠柳毒苷含量最高[田俊生，李天祥，刘虹，等.HPLC法测定不同产地香加皮中杠柳毒苷的含量.中药材，2006,29(8):799-800]。所以，以杠柳毒苷为原料水解制备杠柳苷元是一种较佳的生产方法。

目前已有水解杠柳毒苷制备杠柳苷元专利申请，如专利“一种杠柳苷元的制备方法(申请号200610013621.9)”公开的方法是用酸处理香加皮提取物、香加皮药材等，再经萃取和柱层析分离得到杠柳苷元，该方法具有工艺简单，成本低的优点，但大量使用酸和有机溶剂，不利于环境保护；专利“一种酶法水解制备杠柳苷元的方法(申请号201110210631.2)”公开的方法是采用蜗牛酶、纤维素酶或苦杏仁酶酶解香加皮甲醇提取物，虽然该方法具有得率高的优点，但是酶的成本势必影响该技术的应用。

为了提高杠柳苷元的生产效率，克服现有杠柳苷元生产方法的不足，本发明采用生物转化法制备杠柳苷元(反应式见图1)。筛选获得一株转化能力高的微生物菌株，利用该菌株发酵制备的粗酶液，直接处理香加皮，在粗酶液中糖苷酶的作用下，其中杠柳毒苷转化为杠柳苷元，再经分离获得产品杠柳苷元。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用黑曲霉(Aspergillus niger)HC306菌株发酵制备粗酶液处理香加皮，转化其中的杠柳毒苷为杠柳苷元的方法，较好地克服现有酸水解法的污染问题，也较好地克服了酶水解法的酶成本较高的问题，本工艺具有流程简单、转化得率高和副产物少等优点。

本发明采用的技术方案是：