[发明专利]一种兔MSTN基因的编辑方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9介导的兔MSTN基因编辑方法，应用该技术可实现MSTN基因突变和基因敲除，获得MSTN表达缺失或降低的基因编辑兔，本发明可用于瘦肉型兔基因编辑育种。

背景技术

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子，属于转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族成员，又称生长分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)。MSTN属于TGF-β超家族成员，因此具有TGF-β超家族典型的结构特征，包括N-末端的分泌信号肽、蛋白酶水解位点(proteolytic processing site，RSRR)和成熟肽区的半胱氨酸结构(cystine knot)。MSTN基因的突变能够引起骨骼肌的广泛性增生与肥大，产生“双肌症状”。目前已研究过的不同哺乳物种间的MSTN基因结构均含3个外显子和2个内含子，并且成熟肽氨基酸序列很保守，氨基酸差异很小，均在3个以内。前两个外显子共同编码N端前肽，第三外显子编码C端多肽。C端多肽含有由9个半胱氨酸构成的半胱氨酸结，该半胱氨酸结对MSTN基因编码蛋白的三维结构的稳定和功能的发挥起到关键作用，其结构的破坏将抑制myostatin的信号传导。皮埃蒙特牛中的双肌表型牛就是由于半胱氨酸(C313Y)突变导致的。

小鼠、大鼠、人、猪、鸡、牛、绵羊、狒狒、和斑马鱼等物种的MSTN基因编码序列发生点突变或移码突变，则通常表现出肌肉量显著增加的性状。目前已经在人、牛、绵羊、狗等多种物种中发现了自然发生的MSTN基因的突变，已经发现MSTN基因发生自发突变的有比利时兰牛(Belgian blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等，表现出双肌性状，其突变均发生在exon3。

发现哺乳动物中MSTN基因均含有3个外显子和2个内含子，完整的MSTN cDNA包括一个ORF(Opening Read Fracture)和编码375个氨基酸残基(小鼠和大鼠为376个氨基酸残基)的核苷酸序列。MSTN是一种分泌型多肽，与TGF-β超家族有着相似的典型特征：N端作为分泌信号，与TGFβ超家族有着相同的氨基酸序列；C端有由4个氨基酸(RSRR，Arg-Ser-Arg-Arg)组成类胰蛋白酶水解位点；在C端有6个半胱氨酸残基形成“半胱氨酸结”结构，并通过二硫键形成生物学活性二聚体。MSTN成熟肽序列在不同物种上的同源性很高，小鼠、大鼠、人、猪、马、狗，鸡和火鸡的同源性为100％，牛、绵羊，狒狒与山羊相比仅有1～3个碱基的差别。

MSTN前体蛋白包括信号肽、N端前肽和C端成熟肽，其中成熟肽均为C-末端的109个氨基酸残基。前体蛋白质需经二次蛋白酶解活化，去除信号肽，切割前体蛋白质产生N-端前肽和C-端多肽，C-端多肽通过二硫键相连形成二聚体，构成MSTN成熟蛋白分泌至血液循环，并与N-端前肽以非共价键形式形成LAP(lantency-associated peptide，40kDa)。有人用Myostatin特异性抗体检测到了牛成肌细胞提取物肌肉生长抑制素前体肽(52kDa)的存在和LAP，证明MSTN确实在成肌细胞中合成并且水解加工。

对基因组进行定向修饰一直是生物科学家研究的主题，通过对MSTN基因进行突变、缺失、敲除等遗传修饰，获得基因突变动物，一方面可以构建出具有“双肌症状”的动物模型用于生物学研究和疾病机理研究，另一方面可以达到改进肌肉质量和重量的目的，生产具有商业化性质的优良品种家畜。

基因组编辑(genome editing)技术是通过插入、缺失或替换的手段对基因组进行定点改造，从而获得能以突变基因代替正常基因来研究基因也能够以正常基因代替突变基因来进行基因治疗的功能的科研技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，即非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)。基因组编辑技术可以通过这两种修复途径来实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，基因敲入和定点转基因，因而基因组编辑技术具有广阔的科研和疾病治疗前景。