[发明专利]融合蛋白TAT‑DCF1的新用途

说明书

技术领域

本发明涉及了一种融合蛋白TAT-DCF1的新用途。

背景技术

恶性胶质瘤是成年人中最具侵略性、最致命和最普遍的脑恶性肿瘤。即使外科技术、放射治疗、化学治疗已经有所进步，但是胶质瘤病人的生存中期依然仅维持在14个月。虽然基因治疗是很有潜力的治疗方法，但是对于安全有效的基因运输系统的发展仍然存在问题。此外，在这些治疗方法的途中，即使治疗效果不佳，但是病人仍将承受更多的痛苦，因此，开发低副作用的药物很有必要。

树突细胞因子（DCF1），也叫作跨膜蛋白59（TMEM59），是一种膜蛋白，早先发现它与神经干细胞的分化有关。新近研究结果表明，完整的dcf1基因在胶质瘤细胞中过表达DCF1蛋白，能够显著抑制细胞的增殖、存活并最终通过毁坏线粒体而导致细胞凋亡。人源TMEM59的胞内区域也包含19个氨基酸的肽段，这个肽段可以靶向特异性的膜成分致使自噬降解的发生。DCF1已经被证明可能是一种治疗胶质瘤病人的新途径。

然而，受血脑屏障及血脑间肿瘤障碍的影响，新药的开发比较慢。为了避开这些问题的一个途径是，使用HIV 反式转录激活因子TAT介导的蛋白转导。来源于人类免疫缺陷病毒1的TAT（47YGRKKRRQRRR57）是一种富含正电荷精氨酸的多肽，它不仅能将携带的货物转导进入细胞膜，还能进入线粒体。TAT将与其融合表达的蛋白高效地转导入体外培养的细胞，并表现出相应的生物活性。

DCF1蛋白是大分子膜蛋白，很难进入胶质瘤细胞。为了找到DCF1蛋白的功能结构域并阐述它在体外培养的胶质瘤U251细胞中的相互作用，通过使用TAT帮助DCF1的不同结构域穿透胶质瘤细胞膜，在原核细胞中表达这些融合蛋白并研究它们对U251细胞的作用。

发明内容

发明目的的目的之一在于外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备抑制U251胶质瘤细胞系迁移药物中的应用。

本发明的目的之二在于提供外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备诱导细胞凋亡药物中的应用。

本发明通过将转录反式激活因子TAT信号肽分别连在全长、胞内、胞外、19个氨基酸的DCF1不同结构域序列的N端，构建入pET30a(+)原核表达载体，于原核表达系统RosettaTM2(DE3)菌株中诱导表达融合蛋白，并优化最佳诱导表达的条件，亲和层析法大量纯化融合蛋白，再将融合蛋白与胶质瘤U251细胞或HEK293T细胞孵育，通过CCK8试剂盒检测细胞活力，细胞划痕实验检测细胞迁移速率，细胞免疫荧光法定位TAT-DCF1融合蛋白的亚细胞定位，流式分析细胞凋亡情况，western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化，对融合蛋白引起U251细胞凋亡途径作出判断。

本发明通过原核表达融合蛋白、亲和层析纯化法，大量获取融合蛋白，继而采用CCK8活力检测、细胞划痕、细胞免疫荧光、流式凋亡检测、western blot等方法对融合蛋白对胶质瘤U251细胞的凋亡作用作出判断。结果表明，在最佳诱导条件下（0.2Mm IPTG、OD600=0.6、37℃诱导4h）可以获取大量融合蛋白，且结构完整的TAT-DCF1融合蛋白显著降低了U251细胞的细胞活力和细胞迁移速率，通过引起凋亡相关基因表达量发生改变而导致凋亡。

附图说明

图1为：重组质粒的构建。（A）TAT-EGFP, TAT-DCF1, TAT-DCF1(Cy) , TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP 的扩增产物克隆入pET30a载体的重组质粒示意图。（B）TAT-EGFP, TAT-DCF1, TAT-DCF1(Cy), TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白的示意图。