[发明专利]一种利用水杨酸进行杂交鹅掌楸体胚发生的方法

说明书

本发明公开了一种利用水杨酸进行杂交鹅掌楸体胚发生的方法，包括杂交鹅掌楸悬浮系的建立、液体单细胞的获得及过渡、诱导杂交鹅掌楸体胚的发生步骤，在诱导杂交鹅掌楸体胚的发生时，在培养基中同时添加水杨酸和ABA，或单独添加水杨酸。本发明的利用水杨酸进行杂交鹅掌楸体胚发生的方法，在杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生过程中，加入植物生长调节剂SA有效提高提高体胚诱导率、发育的同步性，提高杂交鹅掌楸体细胞工程种苗繁育的效益。

技术领域

本发明属于组培苗技术领域，具体涉及一种利用水杨酸(SA)进行杂交鹅掌楸体胚发生的方法。

背景技术

近年来，人们不断地加大对植物体细胞胚胎发生的研究，使其在几十年内得到了快速的发展，并取得很大的成果。由于体细胞诱导产生的体胚具备发生数量多、生长速度快、结构完整、繁殖效率高等特点，使体胚发生技术成为植物快速繁殖的有效手段，有利于保存优良的林木品种、缩短优良品种培育时间、加快产业化的发展等，在林业的发展中具有重要意义。

植物体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的有效途径，它可以在一些植物尤其是木本植物生长繁殖周期较长，或者有的植物种子难以萌发中发挥巨大作用。体胚发生主要分为诱导胚性愈伤组织的形成和体胚的形态建成。第一阶段选择外植体，选取未成熟胚、根、茎、叶、花器官等组织诱导形成胚性愈伤组织；第二阶段诱导胚性愈伤组织分化形成体细胞胚。胚性细胞经过一系列的发育形成球形胚，最终形成子叶胚，子叶胚再经进一步培养形成完整的植株。植物直接的体细胞胚胎发生是在外植体包括器官、组织、细胞等直接发育分化成体细胞胚。而间接体胚发生是外植体形成愈伤愈伤组织后进一步发育成体细胞胚，或者形成胚性愈伤组织后经过悬浮培养后形成体细胞胚。

林木体细胞胚胎研究起源于20世纪70年代Rao等对檀香的体细胞胚胎发生的研究。尽管大部分木本植物的体胚发生存在一定难度，但几十年的努力，木本植物通过体胚发生形成再生植株已经达到二百种以上，还有一些用材树种的体胚发生的研究也取得新进展。马尾松、火炬松等部分裸子植物的体细胞胚胎发生体系已经较成熟，能够组织培养技术实现植株再生。陈金慧等首次成功建立杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系，并进一步诱导出体胚苗，加快杂交鹅掌楸的产业化发展。

体胚发生时，外界因素诱导内部发生变化或内部自身因素使调控基因表达，从而完成植物体胚的发生。其主要的影响因素有：外植体选择、基因型、培养基的选择、环境条件、生长调节物质等。其中植物激素在体胚发生中起到不可替代的作用。

1)基因型与外植体的选择

只要是活的植物组织或器官都可作为组织培养的材料。体胚发生会因外植体的状态、类型、基因型等因素的不同而存在很大差异。在进行组织培养过程中，选择的外植体器官分化程度低并且生理状态较好，可以大大提升体胚发生诱导率。因此在进行组织诱导时，通常选择生理状态好、品质优良的材料，可以加大植物体胚诱导的成功率。

由于植物基因型的不同，使得体细胞胚诱导时在激素的使用、培养条件等方面都存在差异。不同基因型的体细胞胚诱导效率存在较大差异，有可能是因为不同基因型的最佳培养条件不同。黄璐等诱导胚性愈伤组织和体胚发生时，发现不同基因型的体胚诱导率存在差异。

2)培养基的选择

通常培养基主要由碳水化合物、氮源、无机盐、维生素等成分组成，每个组成部分都起到重要作用。其中氮源对体细胞胚胎发生有较大的影响。崔凯荣等在培养基中加不同比例的硝态氮及氨态氮诱导枸杞体胚发生时，发现当培养基中只加氨态氮不加硝态氮时，枸杞体细胞胚胎发生诱导率最高。

3)环境条件

通常暗培养环境下有利于木本植物胚性愈伤组织的诱导，待体胚进行成熟培养时则需要光照，光照也有利于降低畸形率。虽然黑暗与光照条件下都可以诱导胚性愈伤组织，但在光照条件下诱导产生的胚性愈伤组织可能会褐化或者体胚再生频率不高。陈金慧等在研究杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生时，发现暗环境有利于胚性愈伤组织生长和体胚发生，体胚发生后及时移至光照条件下培养，有利于体胚发育和植株再生。