[发明专利]评价丙烯酰胺体内暴露的血红蛋白加合物检测方法及应用

权利要求书

1.评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、制备血红蛋白干粉：

取0.5～1mL的红细胞加入1～9体积倍的纯水稀释红细胞，涡旋震荡后于-80±5℃速冻0.5～3h；之后，在20～55℃水浴下解冻得到溶血液；

在溶血液中加入15～30mL酸化异丙醇溶液，于3500～6000rpm离心2～15min；在离心所得上清液中加入10～30mL乙酸乙酯，涡旋震荡后于4±0.5℃放置0.5～4h从而沉淀蛋白；接着于3500～6000rpm离心2～15min，在离心所得的沉淀中重复上述加入乙酸乙酯后涡旋震荡、沉淀蛋白和离心1～3次；最终离心所得的沉淀用正己烷洗涤后干燥，得血红蛋白粉；

2)、衍生及净化：

取20～100mg的血红蛋白粉加入0.8～3mL的甲酰胺和20～100μL的1mol/L NaOH溶液，再加入5～30μL的衍生剂，涡旋混匀；在室温下震荡12～24h进行衍生化，然后在30～60℃水浴继续衍生0.5～6h；所述衍生剂为五氟苯基异硫氰酸酯；

水浴衍生结束后，再加入0.2～2mL的20％NaCl溶液以及20μL同位素内标d8-AAVal-PFPTH和d8-GAVal-PFPTH的混合液，涡旋混合均匀，在转速8000～12000rpm下离心2～15min，取上清液；

将固相萃取柱活化、平衡后，取上清液上样，先用2～3mL淋洗液淋洗，然后2～3mL甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液在40℃下氮气吹干，用流动相溶液定容至1mL，涡旋溶解1min，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；

所述淋洗液为体积浓度5％～10％甲醇水溶液；

3)、色谱条件：

仪器：超高效液相色谱；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；流动相A：0～1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；等度洗脱比例：A:B＝40:60～60:40；进样体积：5～10μL；进样时间：10～15min；

所述色谱柱种类为ACQUTITYHSS T3或ACQUTITYBEH C18；

4)、质谱条件：

仪器：三重四级杆串联质谱仪；质谱定量方法：多重反应监测；离子源：电喷雾负离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速8L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：45psi；毛细管电压：3000～4000V；干燥气温度：300℃；干燥器流速：5L/min；载气：氮气；碰撞气：氮气；

两种代谢物及其同位素的质谱参数

Table1 Mass spectrum parameters of two metabolites and their isotopeconpounds

注：^a为定量离子通道，^b为定性离子通道

5)、结果：

利用上述液相-质谱联用方法，通过标准曲线法对样品进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法，其特征是：所述步骤1)中红细胞的制备方法为：将装在抗凝管中的全血在3500rpm下离心5±0.5min，将上清液和中间层移出，在下层中加入PBS溶液或生理盐水进行清洗、离心，得到红细胞。

3.根据权利要求1所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法，其特征是所述步骤2)中：

当待测样品是人血时，混合同位素内标为d8-AAVal-PFPTH和d8-GAVal-PFPTH，浓度均为1μg/mL；

当待测样品是鼠血，混合同位素内标为d8-AAVal-PFPTH和d8-GAVal-PFPTH，浓度均为10μg/mL。

4.根据权利要求3所述的评价膳食丙烯酰胺中长期体内暴露的血红蛋白加合物同步检测方法，其特征是所述步骤2)中：

所述固相萃取柱为Supelclean^TMLC-18 cartridge、HLB cartridge、Extrelut^TMNT cartridge。