[发明专利]一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法

权利要求书

1.一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10-15 min后在流水下冲洗干净10-15 min，在超净工作台上先用75%酒精中浸泡果荚30-40 s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1%升汞溶液浸泡果荚12-15 min，无菌水冲洗3-5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1%升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1%升汞溶液中加入2滴吐温-20；

（2）初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28-32 d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30 d能诱导愈伤组织；

（3）不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26-28 d；

（4）愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1 cm×1 cm的小块接入分化培养基中培养29-30 d；

（5）生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23-25 d；

（6）炼苗移栽：将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10-14 d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50%，移栽7 d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7 d，移栽后20 d后统计成活率；

步骤（1）中所述的萌发培养基以MS+GA₃1.0-2.0 mg/L+活性炭0.5 g/L；

步骤（2）中用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT 1.0-2.0 mg/L+NAA 0.01-0.1 mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.1-1.0 mg/L+2,4-D 1.5-2.0 mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1-1.0 mg/L+2,4-D1.5-2.0 mg/L；

步骤（3）中所述的增殖培养基以MS+6-BA1.0-3.0 mg/L+IBA0.1-0.30 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20g/L+椰汁100 ml/L；

步骤（4）中所述的分化培养基为MS+ZT0.1-1.0 mg/L+IBA0.1-0.3 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20 g/L+椰汁100 ml/L；

步骤（5）中所述的生根培养基为1/2MS+IBA1.0-3.0 mg/L+椰汁50 ml/L+活性炭1.0 g/L。

2.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的暗培养的温度为17-20 ℃；所述的光培养温度23-25 ℃，光照为1000-1400lx。

3.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤（5）中所述1/2MS为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致。

4.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤（6）中所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成。

5.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤（6）中所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。