[发明专利]检测白血病CDX2基因表达水平的引物和方法

说明书

本发明公开了检测CDX2基因相对表达量的引物、探针和检测方法，其中扩增覆盖CDX2基因的上下游引物和探针分别是CDX2‑F、CDX2‑R、CDX2‑Probe，检测内参基因Abl用上下游引物和探针分别是Abl‑F、Abl‑R、Abl‑Probe。所述检测试剂和方法具有精度高，结果便于判读。且特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上白血病的早期诊断及微小残留病灶(MRD)的监测，对于及时干预治疗、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种临床检验用途的基因检测方法和分子检测引物，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类白血病中的CDX2表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

白血病是一类造血干细胞发育异常的恶性克隆性疾病，随着我国经济的发展，环境污染的加剧及生活方式的改变，白血病的发生率呈现升高的趋势，尤其是在35岁以下中青年人群及儿童中白血病的发病率和死亡率居高不下。白血病的预后一般较差，没有较好的预防和控制措施，病死率高。目前认为，白血病微小残留病灶(minimal residualdisease,MRD)是白血病复发及治疗失败的根本原因。MRD作为独立的预后因素，不仅对评价化疗的疗效、监测白血病复发的意义重大，在指导危险分层后的个体化治疗中亦发挥重要作用。

尾侧型同源盒基因CDX2(caudal-related homeodomin transcription factor2,CDX2)基因是CDX基因家族的一员，作为一种原癌基因，CDX2全长共22kb，定位于13号染色体q12.13，由2个内含子和3个外显子构成，其下游表达的CDX2蛋白通过螺旋环螺旋形式与相应的DNA区域结合，共含有311个单个氨基酸，作为转录因子来调控DNA的表达。正常情况下，CDX2在胎儿期广泛表达，在整个成人期则仅在肠道腺上皮中表达。研究证实CDX2的异常表达与肠化生Barrett食管及胃癌的发生、发展及预后有关，并具有抑制结肠肿瘤的作用。CDX2并不局限于在消化道表达，在泌尿生殖、妇科、头颈部等也显示不同程度的表达。近年来的研究发现CDX2基因参与了干细胞自我更新和白血病转化，通过影响HOX基因表达调控促成白血病的发生，是与白血病发生、发展密切相关的致白血病基因，在大多数的AML、ALL患者中CDX2有不同程度的异常表达。

在实际应用中，用于检测CDX2表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测CDX2表达水平。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应CDX2在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR Green I染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于CDX2基因检测。

发明内容

本发明设计了利用内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测CDX2基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，并以正常人的CDX2表达量作为参照，开发了一种新型的CDX2基因表达水平检测方法。用于白血病辅助诊断及MRD监测的检验方法，主要包括红细胞裂解液；TRIzol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；QIAGEN RNeasy FFPE Kit。

本发明提供了一种检测CDX2基因相对表达量的引物和探针，包括：扩增覆盖CDX2基因的上下游引物CDX2-F、CDX2-R和探针CDX2-Probe，检测内参基因Abl用引物Abl-F、Abl-R和探针Abl-Probe；其碱基序列为：