[发明专利]一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液凝胶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶微乳液凝胶的制备方法，属于生物酶技术领域。

背景技术

脂肪酶(lipase)存在于大多数生物体内，它能够催化甘油酯类化合物水解，因而密切关系到生物体内脂类的消化，运输和加工。此外脂肪酶还具有界面活性，能在油水界面催化疏水性底物的水解。当前生物酶技术快速发展，脂肪酶的应用范围和实施方法不断被拓宽，频频出现于食品、日用化工、油脂化工等领域。然而很多脂肪酶相关的生产过程是在高温下进行的，甚至在一些储存和运输途中也难以保持低温，但由于脂肪酶的热稳定性较差，经历高温后其活性难以复原，这主要是因为脂肪酶的分子链在高温时展开，疏水位点暴露在外，导致了脂肪酶分子之间发生聚集。这种聚集体一旦产生，即使回到适宜温度下仍难以解离。所以只要经历过高温，脂肪酶分子就难以恢复其天然结构，将会失去其催化活性。因此具有良好热稳定性的脂肪酶有着重要的应用价值和大量的实际需求。

目前，提高脂肪酶的热稳定性的方法主要是将脂肪酶固定在各种载体(例如多孔硅，凝胶等)上。这种方法一般需要对载体进行预处理，操作较复杂，而且固定化效率有限。微乳液凝胶的发现为酶固定化领域注入了新的活力。微乳液凝胶固定化酶是在油包水含酶微乳液的基础上发展而来，它既拥有含酶微乳液的优点，也克服了含酶微乳液体系在酶促反应过程之中所面临的主要问题，即酶的重复利用和产物分离。因而更适用于规模较大的工业生产。

发明内容

本发明针对现有提高脂肪酶热稳定性的方法存在的不足，提供一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液凝胶的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种具有良好热稳定性的脂肪酶微乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将脂肪酶与均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺溶解在磷酸盐缓冲溶液中制得混合溶液作为水相；

2)将表面活性剂加入到不溶于水的非极性或弱极性有机溶剂中，溶解后作为油相；

3)将水相在搅拌条件下逐滴加入到油相中，得透明的微乳液，控制水相与油相的体积比为1：10-1：100，且微乳液中W₀值为10；

4)将明胶与水混合，明胶与水的质量比为1：1-1：4，将混合物加热并不断搅拌，直至得到均匀的糊状物；

5)将预热后的步骤3)中所得的微乳液加入到步骤4)所得的糊状物中，搅拌均匀后停止加热，冷却，即得固态的脂肪酶微乳液凝胶。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述步骤1)中控制水相中脂肪酶与均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺的质量之比为1：1-1：10,脂肪酶的浓度为0.1-10mg/mL。

进一步，步骤1)中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM，pH＝7.50。

进一步，步骤2)中所述的表面活性剂为二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠、聚乙二醇对异辛基苯基醚,十六烷基三甲基溴化铵中的一种。

进一步，步骤2)中所述的有机溶剂为正己烷，环己烷，异辛烷，甲苯，石油醚中的一种。

进一步，步骤4)中混合物加热的温度为45-55℃。

进一步，步骤5)中控制糊状物与微乳液的质量比为1：1-1：10。

进一步，所述均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺的分子量为1000-8000Da(道尔顿)。

本发明的有益效果为：

1)本发明提供的脂肪酶微乳液凝胶热稳定性好，经高温加热后，仍能保留很高的酶活性，相对脂肪酶微乳液来说，能保留更高的酶活性；

2)本发明的含酶微乳液凝胶在催化酶促反应之后可方便地分离出来，并且可重复利用。

本发明的脂肪酶微乳液凝胶热稳定性好的作用机理如下：

在脂肪酶微乳液凝胶中，脂肪酶分子分散于纳米级的水相液滴中，同时这些液滴又被固态的凝胶结构彼此隔离，难以靠近。另外，温敏性聚合物PNIPAAm也对提高脂肪酶的热稳定性至关重要。温敏性聚合物PNIPAAm高温时疏水，低温时亲水。因而可随环境温度的升高，自发地与展开的脂肪酶分子链发生疏水相互作用，从而防止与其它脂肪酶分子发生聚集，并在高温撤离后自动释放脂肪酶，帮助其恢复天然结构。这与微乳液中仅依靠液态的油相所产生的隔离效果相比，其阻断脂肪酶分子间相互作用的效果要更胜一筹。这两种途径协同发挥作用，有效提高了脂肪酶的热稳定性。

附图说明

图1为实施例1、实施例2和对比例1所得的产品经失活复性后相对酶活性的比较示意图；