[发明专利]一种农药的毒性测试方法

说明书

技术领域

本发明涉及毒性测试领域，具体涉及一种利用斑马鱼胚胎替代斑马鱼成鱼进行甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂急性毒性测定的方法。

背景技术

斑马鱼(Brachydaniorerio或Daniorerio)原产于孟加拉国、印度等国。俗称蓝条鱼、花条鱼，是隶属幅鳍亚纲(Actinopterygii)、鲤科、短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨热带观赏鱼，因体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。具有易饲养、产卵量大、性成熟周期短、个体小易操作等特点，同时斑马鱼基因与人类基因的相似度高，具有重要的科学研究意义。因此，斑马鱼已成为科学研究中常用的模式生物，广泛应用于生命科学、毒理学、环境科学和农业科学等领域。

目前，已经广泛采用斑马鱼成鱼进行农药急性毒性安全性评价的研究，然而，采用斑马鱼胚胎进行农药急性毒性安全性评价的研究较少，且不同农药结构的化合物毒性差别较大，能否用斑马鱼胚胎进行替代斑马鱼成鱼进行毒性评价差异较大，因此，斑马鱼胚胎能否替代斑马鱼成鱼进行农药安全性评价仍然是一个函待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用斑马鱼胚胎进行甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂急性毒性测试的方法，以替代利用斑马鱼成鱼进行甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂急性毒性测试方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种农药的毒性测试方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）配制药剂试验液：根据所需浓度，用标准稀释液配制5-7个系列浓度的药剂试验液，并置于24孔板中，每孔2mL试验液，每板20孔试验液，4孔稀释水作为板内对照，1板作为1个试验浓度组。

（2）斑马鱼胚胎的挑选：选取健康、活泼的成熟斑马鱼，于采卵前一天按雌∶雄为1 ∶ 2 的比例放入配缸内黑暗条件下驯养，次日上午8点半开灯，使其在光刺激的条件下，自然交配，1h时收集受精卵，用标准稀释水清洗两次收集得到的受精卵，并去除杂质和坏卵，在显微镜下挑选正常发育比率达70％以上的斑马鱼胚胎，收集和挑选过程需要快速、小心。

（3）染毒：用滴管吸取挑选好的胚胎，置于已经准备好的药剂溶液中，每孔添加1枚斑马鱼胚胎，然后将整板染毒斑马鱼胚胎放置于光照培养箱中培养，培养温度为27-28℃，光照：黑暗=14h：10h。每24h更换一次试验药液，更换时需预留少量旧药液，避免胚胎暴露在空气中，产生损伤。

（4）结果观察与计算：观察时间为24h、48h、72h和96h。观察终点为卵凝结、缺乏体节构造、尾芽缺失及无心跳，这些观察将用于死亡的界定，以上的任何阳性结果都表示斑马鱼胚胎已经死亡。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、斑马鱼胚胎为体外受精、体外发育、胚胎全透明，可以在显微镜下直接观察斑马鱼胚胎发育的全过程，生长发育快，受精后24小时主要器官原基会基本形成，便于研究织器官的发育过程和功能；可以全程、完整观察和研究其内部所有器官和结构的变化。

2、斑马鱼成鱼为动物保护协会明确保护的动物，而斑马鱼胚胎则未在列，以胚胎代替成鱼用于毒性试验还可以避免杀死动物或解剖动物，这符合环境毒理学为保护动物权利而寻求替代的毒性试验材料的发展方向。

3、斑马鱼胚胎较斑马鱼成鱼更容易获得，斑马鱼繁殖能力强，雌鱼每次可产卵100-1000枚，可快速获得大量胚胎。饲养比较方便且费用低，所需的饲养场所不大，取材比较方便。

4、用斑马鱼胚胎替代传统斑马鱼成鱼进行甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的急性毒性试验既可以减少实验动物数量、试验场地和受试药物的用量，降低研发成本，也有助于快速在细胞和分子水平阐明药剂的毒性作用机理。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于解释本发明，但不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

一、具体实施例

利用斑马鱼胚胎和斑马鱼成鱼进行吡唑醚菌酯急性毒性的测定，主要包括以下步骤：

1、吡唑醚菌酯对斑马鱼胚胎的急性毒性测试

（1）标准稀释水的配制：

（2）吡唑醚菌酯染毒液的配制：