[发明专利]一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法。

背景技术

近年来，我国环境污染日益严重，成为当前人类面临的一个重大问题。特别是工业及生活污水中的氨氮污染，可以引起水体富营养化和水体生态系统紊乱等一系列问题。生物硝化脱氮是目前水处理领域研究的热点，由硝化作用和反硝化作用共同完成，其中硝化作用分为两个阶段，首先由亚硝化细菌把氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后由硝化细菌把亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。但是目前已运行的生物硝化脱氮池达标率不高，解决问题的关键在于提高池内亚硝化细菌和硝化细菌的生物量及其活性，这就需要一个快速检测亚硝化细菌和硝化细菌的方法，用以指导生物硝化池的运行。

通常所用的亚硝化细菌鉴定方法一般为16S rDNA扩增法，早在很久之前该方法就普遍用于细菌菌种的鉴定。该法以细菌16S rDNA区域通用引物作为扩增引物，PCR扩增结束后要把PCR产物测序、比对后才只能将菌种鉴定到属，这样用通用引物进行的PCR扩增结果特异性不高，而且还延长了菌种鉴定的周期，达不到快速检测的目的。

因此找寻针对亚硝化细菌PCR鉴定方法的最佳PCR条件成为本领域技术人员难以解决的问题。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种亚硝化细菌的PCR鉴定方法，以亚硝化细菌的专属特征性基因-氨单加氧酶基因(amoA)为模板设计合成一对特异性引物，并以亚硝化细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过对PCR扩增条件优化，然后对PCR扩增产物进行琼脂糖水平电泳，根据电泳泳道中条带的有无及大小，判断该细菌菌株是否属于亚硝化细菌或者混合菌群中是否含有亚硝化细菌。本方法是以用氨单加氧酶基因为模板设计的特异引物为PCR扩增引物，实验结果特异性强，实验操作简单，结果可靠性高，并通过优化PCR扩增条件缩短了亚硝化细菌的鉴定周期，较常规PCR扩增时间缩短26％以上，为亚硝化细菌种群的鉴定提供了一个快速、有效的鉴定方法。

现有技术中PCR扩增在PCR仪内完成，而扩增条件基本一致，这已成为了本领域的基本常规操作，但是发明人发现针对本发明的目的，常规的PCR扩增条件难以适应，存在准确率较低且扩增时间较长的缺陷，难以适应本发明的要求，故此发明人针对这一缺陷对PCR扩增条件进行了改进。

本发明的具体技术方案如下：

⑴引物的设计与合成：以亚硝化细菌的专属特征性基因氨单加氧酶基因(amoA)为模板，根据引物设计原则，利用primer 5.0软件设计并合成一对特异性引物，引物具体序列如下：

上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示；

下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如Seq ID No:2示；

⑵菌种基因组DNA的提取：采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测菌种的基因组DNA；

⑶PCR扩增体系：分别以步骤(1)中合成的特异引物为PCR扩增引物，以步骤(2)中提取的基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系(25ul)如下：