[发明专利]一种检测MET基因14外显子突变的探针库、检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种检测MET基因14外显子突变的探针及检测方法。该方法可以精准地富集MET基因14外显子突变序列，所得DNA样本库可进一步结合下一代测序技术（NGS），精准地判断病人的MET基因14外显子突变情况，并为相关肿瘤的诊断，预后，及临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。

背景技术

原发性肺癌（以下简称肺癌），发生于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害民众的生命与健康。

在我国，肺癌发病率和死亡率在男性常见恶性肿瘤中均占首位；在女性常见恶性肿瘤中分别占第一、二，仅次于乳腺癌的死亡人数。根据全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示，2010年，我国新发肺癌病例60.59万(男性41.63万，女性18.96万)，占恶性肿瘤新发病例的19.59％(男性23.03％，女性14.75％)。肺癌发病率为35.23/10万(男性49.27/10万，女性21.66/10万)。同期，我国肺癌死亡人数为48.66万(男性32.58万，女性16.08万)，占恶性肿瘤死因的24.87％(男性26.85％，女性21.32％)。肺癌死亡率为27.93/10万(男性39.79/10万，女性16.62/10万)。从分布来看，上海、北京、东北和沿海地区的几个较大城市的死亡率最高。

目前肺癌的治疗方式主要是手术、化疗、放疗，其中化疗是中晚期肺癌的主要治疗方式，但是其毒副作用较大，且个体间治疗疗效差异较大。随着肿瘤生物学的发展，及肿瘤发生机制的进一步探索，分子靶向治疗因其治疗有效率高、毒副作用小的特点，逐渐成为晚期肺癌的常规临床治疗方案。MET蛋白由原癌基因c-MET编码，是肝细胞生长因子HGF的受体。MET与多种细胞行为相关，参与细胞的信号传导、细胞骨架重排，促进细胞的增殖与分化。通过基因扩增或者过表达的方式激活MET的激酶活性可以促使细胞的癌变（8-10）。MET扩增在未经治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中并不常见，发生频率约为2-4%（8,9,11）。

从2014年首次发现MET基因14外显子跳读突变到现在，已经有多个研究针对不同的肿瘤类型对该突变类型进行研究。MET基因14外显子跳读突变在肺腺癌中的发生频率约为4%，而在肺肉瘤样癌中的频率高达22%。该突变的机理是，MET基因14外显子是MET蛋白泛素化降解过程中的结合位点，其丢失会导致MET蛋白无法被泛素化降解，从而引起MET蛋白的持续表达。

在非小细胞肺癌中，携带MET基因14外显子跳读突变的患者对MET抑制剂（克唑替尼、卡博替尼）在临床试验中有较好的应答。并且该突变与EGFR、ALK、KRAS、BRAF等突变不共存，意味着该靶点在肺腺癌中有较高的特异性。所以在NCCN指南中，建议MET基因14外显子跳读的患者选择克唑替尼进行治疗。MET基因14外显子跳读也成为肺腺癌中重要的一类分子分型。

MET基因14外显子跳读突变检测目前只有实时荧光定量PCR的试剂盒，其特点是检测方法简单，易于操作，但是需要提取RNA，对样本要求较高，实验结果判读较复杂，并且一次只能检测MET基因14外显子跳读突变，无法同时检测其它突变类型，所以实际上应用范围有限。

现有的主流基因突变检测方法主要集中于以下3个技术：

1）PCR突变检测

基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括：其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。

2）Q-PCR（定量PCR）检测

基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括：不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。

3）基因芯片技术

用高精度技术将DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括：不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。

发明内容

针对上述技术问题，本发明人通过大量实验，开发了用于检测MET基因14外显子突变的方法，该方法利用探针液相捕获、二代测序技术，不仅可以实现几千倍地富集的MET基因14外显子及其附近内含子的DNA片段，而且实现了较高的检测特异性和敏感性。