[发明专利]用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物及反应体系

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物及反应体系。

背景技术

Sanger法测序-PCR扩增产物，是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP(其中一种为α-32P标记)的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

毛细管电泳技术-VNTR产物，毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。基本机构包括进样系统、毛细管、检测系统、高压电源、清洗系统、温控系统等。它是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高电压作用下,带电粒子在毛细管内电解质溶液中迁移,迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)的矢量和。中性粒子的电泳速度为零,其迁移速度相当于EOF的速度。各种粒子因迁移速度的不同而实现分离。

数目可变串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)又称小卫星DNA(MinisatelliteDNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一1000不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核苷酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。

FOXL2基因编码区全长共1131bp，属于高GC含量序列，在PCR过程中有一定难度，同时PCR过程中的单链易形成茎环结构。由于FOXL2基因编码区存在基因突变的情况且突变情况复杂，目前已知的突变位点有200余个，对PCR体系及引物都有较高要求。因而需要一套高效准确的引物和反应体系以准确确定FOXL2基因编码区的基因突变位点。

发明内容

本发明的目的在于提供用于FOXL2基因编码区进行PCR复制和扩增的引物及PCR反应体系和程序，以确定FOXL2基因编码区的基因突变位点。