[发明专利]一种人调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速评价外周血中调节性T细胞的免疫抑制功能的检测方法。该方法用于监测调节性T细胞的抑制活性，属于生物技术领域。

背景技术

人体的免疫系统受多重精密调节，其中调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)发挥重要的免疫负调节作用，是阻断免疫监测和抑制有效抗肿瘤免疫的主要免疫细胞。Treg细胞在体内所占的比例很少，在正常人外周血中仅占CD4⁺细胞的5-10%左右，而具有免疫抑制能力的Treg细胞比例更低。Treg细胞表达多种细胞表面分子，如CD4、CD25、FoxP3、CTLA4、GITR和CD103等，如何识别检测具有免疫抑制功能的特异性Treg细胞是目前细胞治疗研究的重点。早期曾认为转录因子FoxP3是Treg细胞最特异的标记物，但是仅表达FoxP3不足以定义Treg细胞及决定Treg细胞的功能和表型，最新研究发现，还有其他的分子标志影响了Treg细胞的成熟和功能。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明在现有检测技术基础上，优化了一种体外检测调节性T细胞免疫功能的方法，利用Helios结合CD4/CD25/FoxP3作为标记功能性Treg细胞的方法，在总体调节性T细胞中通过发现靶位找到具有实际调节功能的细胞群，可以更有效的检测具备免疫抑制功能的细胞群体，达到科学量化具有抑制活性的调节性T细胞的目的。

下面对本发明步骤进行详细描述：

1 采集：取外周血5-10ml；

2 处理样本：取流式管分别加入100μl外周血样本，每管加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温孵育15分钟，1500转/分20℃离心5min洗涤1遍，加入2mlPBS液相同条件再次洗涤1遍，加入100μl PBS液重悬成单细胞悬液；

3. 表面抗体的标记：加入抗体CD4、CD25各5μl标记调节性T细胞表面分子标记，室温避光孵育20分钟，PBS液1500转/分20℃离心5min洗涤1遍；

4.细胞固定破膜：加入1ml 固定破膜剂：10%甲醛/0.2%Triton-X/PBS重悬细胞，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍；

5.核内抗体染色：加入100μl PBS液重悬细胞，加入核内抗体Foxp3、Helios各5ul标记核内抗体，室温避光孵育1小时，加入2ml PBS液洗涤2遍；

6.流式检测：加入400μl的PBS液重悬成单细胞悬液，滤网过滤加入流式孔板，流式细胞仪上机检测CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Helios⁺细胞占CD4⁺细胞比例；

7 单个核细胞分离：外周血全血样本按照体积比1：1的比例将外周血缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液中，2500转/分 离心25-30分钟，收集中间白膜层的单个核细胞，加入15ml PBS液，1800转/分，离心10分钟，洗涤2遍；

8 分选：磁珠分选CD4⁺CD25⁺Treg细胞，其中阴性分选CD4⁺细胞，阳性分选CD25⁺细胞，CFSE实验检测不同组CD4⁺CD25⁺Treg细胞对CD4⁺CD25^-Th细胞的免疫抑制功能；

9检测：构建Helios siRNA，将Helios siRNA转染到分选后的ALL CD4⁺CD25⁺Treg细胞中，CFSE实验检测Treg细胞免疫抑制功能，未转染Treg细胞作为对照组。

综上所述，本发明的目的是针对目前对Treg细胞分子标记的不完善，提供一种新的具有较强免疫抑制功能的人外周血Treg细胞免疫标记，从而检测T细胞的免疫抑制功能。

附图说明

图1：ALL与健康儿童外周血中CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Helios⁺Treg细胞的比例；

图2：ALL与健康儿童外周血中Treg免疫抑制功能的差别；

图3：Helios表达对Treg免疫抑制功能的影响；

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

Treg细胞检测