[发明专利]番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR及其克隆方法与应用方法

说明书

本发明提供了一种番茄抗晚疫病基因SpNBS‑LRR，其DNA分子序列如SEQ ID NO.1所示；提供了该基因的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板进行PCR扩增；将得到的PCR产物与pMD‑19T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序；还提供了该基因的应用方法，培育抗晚疫病番茄植株。本发明方法得到的过表达植株中SpNBS‑LRR的表达量高于野生型植株，其抗晚疫病效果更优。本发明通过过表达SpNBS‑LRR基因使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的克隆及应用。

背景技术

番茄是一种世界范围内广泛种植的经济、园艺作物。在其生长过程中，由各种病原物引起的植物病害，严重影响了番茄的产量，造成了巨大的经济损失。近年来，晚疫病成为最严重的番茄病害之一，对农业生产及经济发展造成了重大损失。虽然化学农药对晚疫病的发生和蔓延有一定的控制作用，但由此引发的环境污染，病原菌抗药性等问题，依旧给农业生产带来了极大的困扰，因此，研究番茄抗病的分子机制，用生物学方法提高番茄对晚疫病的抗性成为了关键问题。

在自然界中，包括番茄在内的植物经常遭受各种病原菌的入侵，严重影响它们的生长发育。为了抵御这些病原菌，植物进化出了一系列的免疫机制。当病原菌入侵植物时，其保守分子被植物的胞外跨膜受体所识别，激活病原物相关分子模式触发免疫(PTI)。尽管PTI成功抵御了大部分病原菌的入侵，少数病原菌进化出了相应的效应因子来突破PTI防线。植物中抗性基因(R基因)所编码的抗性蛋白(R蛋白)可以识别这些效应因子，从而激活高效的免疫反应，效应子触发免疫(ETI)。

NBS-LRR基因是植物基因组中一类高度保守且丰富的R基因。其编码的NBS-LRR蛋白可以识别病原物的效应因子Avr蛋白进而引起过敏反应(HR)。HR反应可以导致初始侵染部位的植物细胞程序性死亡抑制病原菌的生长。目前，研究者们已经从多种植物中克隆得到了大量NBS-LRR基因并对其在植物免疫中的功能进行了探究。如从抗性辣椒品系HDA149中得到的CaRKNR基因，对其进行沉默后辣椒对于线虫的抗性明显下降。小麦Pm3b基因可为其提供白粉病的小种特异抗性。在水稻中，Pi64可以提高其对稻瘟病菌的抵抗能力，另一个基因OsRP1L1可以提高其对于白叶枯病的抗性。同时丝瓜中的NBS-LRR基因与叶卷曲和花叶病抗性有关。

发明内容

本发明的目的在于一种克隆番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的方法，并提供该基因在番茄抗晚疫病中的应用方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一个番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA为模板，以SpNBS-LRR-FP、SpNBS-LRR-RP为特异性引物，进行PCR扩增；所述特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

克隆所用特异性引物具体为如下：

SpNBS-LRR-FP：CGGGATCCATGTGTGTGGGAAGAGTTACAGATT，

SpNBS-LRR-RP：CGAGCTCTTACTCTAGTCTTTCAAGTTTGGGG；

将得到的PCR产物与pMD-19T克隆载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落进行测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的应用方法，用于培育抗晚疫病番茄植株。

具体通过以下技术方案实现：