[发明专利]一种畜禽养殖废水中抗生素联合毒性效应的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种畜禽养殖废水中抗生素联合毒性效应的分析方法，属于水环境分析检测领域。

背景技术

近年来大量的抗生素作为兽药和饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业中，在动物疾病防治、提高饲料转化效率、促进动物生长发育方面发挥着重要作用。然而，这些抗生素并不能被畜禽全部吸收，而是通过粪便、尿液的形式排出体外，最终以废水形式进入养殖废水或周边的水体环境介质中，给生态健康带来不良影响，并通过食物链传递，对人体健康产生潜在危害。目前，畜禽养殖行业废水中抗生素的检测研究发现：畜禽养殖废水中普遍存在磺胺类、四环素类、大环内酯等多种抗生素。关于上述部分抗生素的分析检测，已有相关的文献和专利，其中CN 105929047A公开了一种测定畜禽养殖废水中抗生素的方法。

这些分析检测手段基本上是基于化学分析的结果，定量分析环境中某些已知痕量或微量污染物的污染水平（ng/L~mg/L）。然而，化学分析手段并不能分析检测各种未知污染物的污染水平，也不能定性分析复杂废水中多种抗生素的综合毒性效应。因此，为了对畜禽养殖行业废水中抗生素的环境风险进行评估，本发明在传统的化学分析手段基础上，结合SPE前处理技术，应用CCK-8细胞毒性实验手段，以直接、全面地评估各种抗生素对环境和生物的综合效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种联合固相萃取（SPE）-细胞毒性（CCK-8）测定畜禽养殖行业废水中抗生素联合毒性效应的分析检测方法，本方法在化学分析方法的基础上，采用CCK-8细胞毒性实验研究了废水中抗生素的综合毒性，为进一步评价废水中抗生素对生态环境和人体健康产生的潜在危害提供数据支撑和理论指导。

本发明的技术方案是，提供一种畜禽养殖废水中抗生素联合毒性效应的分析方法，包括以下步骤：

（1）取畜禽养殖废水，加入磷酸，调节pH值至3-4；

（2）将步骤（1）处理的水样，用玻璃纤维滤膜过滤得到滤液；

（3）将滤液通过活化后的HLB固相萃取柱，然后对HLB固相萃取柱用超纯水淋洗后进行真空干燥处理；

（4）用体积比为0.5-3 ：100的甲酸与甲醇混合溶液洗脱HLB固相萃取柱，收集洗脱液；

（5）将洗脱液浓缩，得到浓缩液；

（6）将浓缩液用二甲基亚砜定容，将定容后的溶液用孔径为0.1-0.5微米的滤膜过滤，并将得到的滤液灭菌，得到灭菌样品；

（7）取灭菌样品，使用无激素胎牛血清的无酚红培养基进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的稀释样品；

（8）将处于对数生长期的HepG2细胞用于药物刺激实验，待细胞贴壁后，将稀释样品对细胞进行暴露，通过CCK-8试剂盒对细胞活性进行检测，根据细胞活性的大小来表征抗生素联合毒性效应。

进一步地，步骤（5）中，先用旋转蒸发，再用氮吹仪吹扫进行浓缩。氮吹仪吹扫可至近干，最大程度地浓缩，减少浓缩液中溶剂等挥发性的残留，避免其对测试结果产生影响。

进一步地，步骤（3）中，滤液以不超过5mL/min的流速通过活化后的HLB固相萃取柱。

进一步地，步骤（2）中，所述玻璃纤维滤膜的滤孔孔径为0.2 微米。

进一步地，步骤（7）中，所述稀释样品中的二甲基亚砜的体积浓度不超过1‰。

进一步地，步骤（3）中，使用体积比为0.5-1.5 ：1的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液对HLB固相萃取柱进行活化。优选地，二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1 ：1。

进一步地，步骤（6）中，在无菌环境下进行过滤。

进一步地，步骤（3）中，真空干燥处理的时间不少于60分钟。

进一步地，步骤（4）中，甲酸与甲醇的体积比为1-1.5 ：100。

该方法所分析的抗生素联合毒性效应中的抗生素不但包括能通过化学分析方法检测到的畜禽养殖废水中普遍存在磺胺类、四环素类、大环内酯类抗生素等；也包括低于化学分析方法检测限，但实际存在于废水中的其他抗生素。

本发明的有益效果是，本发明通过前处理、过滤、富集和洗脱方法有效地分离出畜禽养殖行业废水中的抗生素。在此基础上，本发明借助HepG2细胞系，采用CCK-8分析手段，可同时检测畜禽废水中所有抗生素的联合效应，从而解决了单纯使用化学分析方法无法检测不同抗生素在复杂环境中产生的加和、增强、拮抗、独立和协同作用等联合效应问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。