[发明专利]一种去除TAQDNA聚合酶中核酸污染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法。

背景技术

基于PCR的非常的敏感性，微量的核酸污染可能会导致不希望的假阳性结果。一些基于原核生物持家基因，如16S，的检测方法，微量的核酸污染会造成非常大的问题，造成大量的假阳性结果，无法正确地检测病原体。这种核酸污染可能来自PCR所用的水，dNTPs，引物，PCR缓冲液，PCR反应管和TAQ DNA聚合酶，前5种核酸污染可以用工程控制(engineering controls)避免或消除，TAQ DNA聚合酶中的核酸污染是主要的问题。通常需要除去或基本上消除来自TAQ DNA聚合酶中的DNA或RNA。这些诊断所用试剂蛋白酶绝大部分是用原核细胞表达纯化的，有些产品没有采取消除核酸污染方法，或没有有效的完全消除污染的DNA的方法。目前市场上常用的多种公司DNA聚合酶，都或多或少含有细菌DNA污染。从RNA样品除去DNA的常用方法是用I型脱氧核糖核酸酶(DNase)处理RNA样品，然后通过加热失活或结合树脂的步骤除去DNase I，但该方法不能很好地消除TAQ DNA聚合酶中DNA。广谱核酸酶Binuclease可将核酸水解为3-5bp的寡聚核苷酸，再经过色谱层析等方法消除污染的核酸，然而Binuclease是耐热酶，微量的残存的Binuclease会水解PCR系统中的引物和模板，降低PCR的敏感性甚至造成假阴性结果。

虽然在TAQ DNA聚合酶纯化过程中采用了一定的消除核酸的方法和步骤，比如添加DNase和RNase消化DNA和RNA，但这并不能完全消化核酸，主要目的是减少蛋白样本的粘稠度，以便于以后的蛋白纯化步骤。初步纯化TAQ DNA聚合酶后，可以用聚乙烯亚胺(PEI)沉淀，水/有机两相体系沉淀法去除一部分大肠杆菌DNA，但也不能完全去除污染的核酸。多年来，已经发展了很多种进一步去除TAQ DNA聚合酶中污染的细菌DNA方法，例如物理射线处理，化学物质处理，物理射线结合化学物质处理，生物酶处理(核酸内切酶DNase I,核酸外切酶III以及限制内切酶)，及多种步骤及物质联合处理。这些方法已经过单独测试过，也有不一致的结果报道，此外，大多数净化程序导致Taq聚合酶性能下降。有些方法，如核酸内切酶DNase I处理只能水解DNA，无法处理RNA。最重要的是，这些处理对于消除非常低分子量的DNA片段(短于200bp)效果不佳。

广谱核酸酶Binuclease作用于所有形式的核酸，包括双链DNA、DNA：RNA杂交分子、单链DNA、单链RNA等等，将之降解为小于等于4个核苷酸长的寡核苷酸链，再经过色谱层析等方法很容易消除污染的核酸。然而Binuclease是耐热酶，微量的残存的Binuclease会水解PCR系统中的引物和模板，降低PCR的敏感性甚至造成假阴性结果。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法，通过Binuclease水解TAQ DNA聚合酶中污染的核酸，并通过本发明的特定方法完全除去Binuclease，从而达到完全消除TAQ DNA聚合酶样本污染的核酸。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

一种去除TAQ DNA聚合酶中核酸污染的方法，包括如下步骤：

TAQ DNA聚合酶与广谱核酸酶Binuclease直接孵育处理，用镍树脂结合TAQ DNA聚合酶，洗涤镍树脂，去除广谱核酸酶Binuclease及其水解产物。

同时，上述的方法还可以替换为：

TAQ DNA聚合酶先结合到镍树脂，再用适量的广谱核酸酶Binuclease注入镍树脂，孵育处理，洗涤镍树脂，去除广谱核酸酶Binuclease及其水解产物。

优选地，所述镍树脂使用其他的二价金属(例如Ni，Co，Cu，Fe)琼脂糖树脂或磁珠替代。

优选地，本发明答方法还进一步包括固定初步生产的TAQ DNA聚合酶量，用不同梯度单位的广谱核酸酶Binuclease直接孵育处理，确定最佳广谱核酸酶Binuclease用量的步骤。

优选地，使用分子筛法去除广谱核酸酶Binuclease及其水解产物。

优选地，使用离子交换法去除广谱核酸酶Binuclease及其水解产物。