[发明专利]生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种生产米尔贝霉素的重组链霉菌，相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的至少一个基因是失活的：编码SEQ ID NO：8或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2、编码SEQ ID NO：9或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3、编码SEQ ID NO：10或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4和编码SEQ ID NO：11或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。本发明还涉及产生所述重组链霉菌的方法和使用所述重组链霉菌生产米尔贝霉素的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及制备生产抗生素、特别是米尔贝霉素的重组工程化链霉菌的方法和获得的重组链霉菌及其应用。

发明背景

米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年改良于1986年正式以商品名米尔贝肟(milbemycin oxime)上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。

目前能产米尔贝霉素的菌株有米尔贝霉素链霉菌(Streptomycesmilbemycinicus)、冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)例如吸水链霉菌金泪亚种(Streptomyces hygroscopicussubsp.aureolacrimosus)和灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)。它们除主要产生有效组分米尔贝霉素A3/A4外，还可产生近三十多种米尔贝霉素类似物，其中常见的有C5-O-甲基米尔贝霉素B2、B3、β1、β2、α9和α10(US4144352)。这些类似物的产生不仅会降低米尔贝霉素A3/A4的产量，而且会严重影响米尔贝霉素A3/A4后期的分离纯化。

向文胜等报道通过基因工程改造获得了去除米尔贝霉素B2、B3、β1和β2以及南昌霉素的重组冰城链霉菌(CN 103468625 B)。但是还有一类米尔贝霉素类似物α9和α10(图1)在米尔贝霉素提取纯化过程中很难彻底去除(Takiguchi Y et al.1980,Milbemycins,anew family of macrolide antibiotics:fermentation,isolation and physico-chemical properties.J Antibiot(Tokyo).1980Oct；33(10):1120-7)。目前本领域尚未鉴别链霉菌中关于米尔贝霉素类似物α9和α10的合成途径，因此没有关于通过改造相关途径而降低或去除米尔贝霉素类似物α9和α10的相关报道。本领域需要能够在生产米尔贝霉素例如米尔贝霉素A3/A4的同时减少或阻断杂质组分例如米尔贝霉素类似物α9和α10的方法和手段。

发明内容

本发明人意外地发现失活链霉菌中的本发明所述基因mpca2、mpca3、mpca4和mpca5中的至少一个时，使用该链霉菌生产米尔贝霉素时能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，而不影响或者有利于米尔贝霉素的生产，简化米尔贝霉素提取纯化工艺，降低生产成本。在某些情况中，使用本发明的重组链霉菌生产米尔贝霉素时不但能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，还能够提高有效组分米尔贝霉素A3/A4的发酵单位。

本发明提供了一种重组链霉菌，使用该重组链霉菌生产米尔贝霉素时，相对于使用相应的野生型或起始链霉菌生产米尔贝霉素时，降低或完全去除米尔贝霉素类似物α9和α10杂质组分含量。