[发明专利]核酸的等位基因特异性扩增

说明书

本申请是国际申请日为2010年12月10日、国际申请号为PCT/EP2010/007560、进入国家阶段的申请号为201080055770.6、发明名称为“核酸的等位基因特异性扩增”的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸扩增领域，并且具体地涉及等位基因特异性扩增领域。

背景技术

核酸的等位基因特异性扩增允许靶序列的同时扩增和分析。当靶核酸在其序列中具有一个或多个变异（多态性）时，通常使用等位基因特异性扩增。核酸多态性用于DNA概况分析（法医学、亲权认定、用于器官移植的组织分型）、遗传作图、区分微生物的致病菌株以及罕见突变的检测，例如在癌细胞中出现、在具有正常DNA的细胞背景中存在的那些。

在成功的等位基因特异性扩增中，扩增靶核酸的所需变体，同时不扩增其他变体，至少不扩增至可检测水平。一般的等位基因特异性扩增测定涉及用这样设计的至少一种等位基因特异性引物的聚合酶链反应（PCR），从而使得引物延伸仅在引物与靶序列的所需变体形成杂交体（hybrid）时发生。当引物与靶序列的不希望有的变体杂交时，引物延伸被抑制。

已提出了增强引物的等位基因特异性的许多方法。然而，对于缺乏PCR特异性的许多临床相关的核酸靶仍是问题。因此，完全需要设计等位基因特异性引物的新方法。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，所述靶以几个变体序列的形式存在，该方法包括

（a）使第一种和第二种寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中第一种寡核苷酸与靶序列的一个或多个变体至少部分互补，并且第二种寡核苷酸与靶序列的一个或多个变体至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个内部选择性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二种寡核苷酸，其中所述聚合酶能够在所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时优先延伸所述第二种寡核苷酸，并且在所述选择性核苷酸不与靶形成碱基对时基本上更少。

在第二个方面，本发明涉及检测靶序列变体的方法，所述靶以几个变体序列的形式存在，该方法包括

（a）使第一种和第二种寡核苷酸与靶序列的至少一个变体杂交；其中所述第一种寡核苷酸与靶序列的一个或多个变体至少部分互补，并且所述第二种寡核苷酸与靶序列的一个或多个变体至少部分互补，并且具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个内部选择性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二种寡核苷酸；其中所述聚合酶能够在所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时优先延伸所述第二种寡核苷酸，并且在所述选择性核苷酸不与靶形成碱基对时基本上更少；和

（c）检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体的存在。

在第三个方面，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的试剂盒，所述靶以几个变体序列的形式存在，该试剂盒包括

（a）与靶序列的一个或多个变体至少部分互补的第一种寡核苷酸；和

（b）具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个内部选择性核苷酸、与靶序列的一个或多个变体至少部分互补的第二种寡核苷酸。

在第四个方面，本发明涉及用于执行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸，所述靶以几个变体序列的形式存在，该寡核苷酸包括

（a）与所述靶序列的一个或多个变体的部分至少部分互补的序列；

（b）与靶序列的仅一个变体互补的至少一个内部选择性核苷酸。

在第五个方面，本发明涉及用于靶序列的等位基因特异性扩增的反应混合物，所述靶以几个变体序列的形式存在，该混合物包括

（a）与靶序列的一个或多个变体至少部分互补的第一种寡核苷酸；和

（b）与靶序列的一个或多个变体至少部分互补，但具有与靶序列的仅一个变体互补的至少一个内部选择性核苷酸的第二种寡核苷酸。

附图说明

图1显示了根据本发明使用各种核酸聚合酶和具有内部选择性核苷酸的引物的等位基因特异性扩增结果。

图2显示了使用各种核酸聚合酶和具有3’选择性核苷酸作为对照的各种引物的等位基因特异性扩增结果。

图3显示了根据本发明使用各种核酸聚合酶和具有内部选择性核苷酸的各种引物的等位基因特异性扩增结果，包括具有蝎子ARMS形式的引物。

图4显示了可以根据本发明使用的蝎子ARMS形式的结构的示意图示。

具体实施方式

定义