[发明专利]焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种焦磷酸测序法联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒和检测方法。

背景技术

Kras基因是公认的癌基因，参与EGFR信号的传导过程。早在2008年6月在美国肿瘤学会(ASCO)年会上发布了临床研究结果，即Kras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而Kras野生型患者更可以从这类药物治疗中获益。同年10月，Kras基因突变检测被写入最新版(2008年第三版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者应检测Kras基因状态，二是只有Kras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当Kras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯/易瑞沙等进行分子靶向治疗。

目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量PCR，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。

Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1～5％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。但是针对临床上一些特殊标本，如血浆、胸腹水等来源的标本，5％的检测灵敏度远远不够。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种焦磷酸测序联合阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物。

本发明还要解决的技术问题是一种焦磷酸测序联合阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

本发明最后要解决的技术问题是焦磷酸测序联合阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物在检测KRAS基因12和13密码子低频突变中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.：1～2所示的扩增引物、SEQ ID NO：3所示测序引物、SEQ ID NO：4所示扩增阻滞引物；

其中，SEQ ID NO：2其5’端标记生物素；SEQ ID NO：4其3’端磷酸化处理；

以上核酸序列在一次检测中共同使用，其中，SEQ ID NO.：1～2所示的扩增引物用于扩增KRAS基因12和13密码子。

本发明中，通过引入扩增阻滞引物，降低了野生型序列的扩增，相对增加了突变基因型的扩增，结合焦磷酸测序技术大大提高了检出灵敏度。相比于现在临床上普遍采用的ARMS检测KRAS基因12、13密码子突变的方法(1％灵敏度)，检测灵敏度提高至0.1％，提高了临床标本的阳性检出率，可以为更多的患者提供了准确的用药参考。

一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变试剂盒，它包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂；

(2)PCR反应试剂：PCR缓冲液，引物SEQ ID NO：1～4，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μL Taq DNA聚合酶；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；