[发明专利]一种软骨细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的分离培养方法。

背景技术

关节软骨是一种由软骨细胞、软骨基质和II型胶原组成的透明软骨，关节的创伤和炎症均可引起关节软骨的损伤。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响了他们的日常生活。由于关节软骨再生能力有限，一旦损伤，难以自行修复，关节软骨的损伤修复一直是骨科研究的重要课题之一。

软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程的最终目的就是得到高质量的修复组织和长期有效的功能，为病人最终解决痛苦。从这种意义上看，组织工程方法是目前治疗关节软骨损伤最有希望的方法，是目前软骨损伤修复研究的主要方面。近年来，研究者致力于应用组织工程学治疗修复关节软骨损伤的研究，但其前提条件是获取足够数量的软骨细胞，即关节软骨细胞的体外分离、体外培养及扩增问题。

目前，软骨细胞体外分离的方法主要有组织块机械分离法、酶一步消化分离法和酶两步消化分离法。这些方法由于操作的细节不同，最终获得的软骨细胞在数量与质量上出现了明显的差异。组织块机械分离法虽然操作方法简单，但是细胞分离周期长，只适合于细胞需求量少的研究。胶原酶消化法相对于组织块机械分离法来说，细胞获得周期较短，但是，由于不同研究者使用的酶种类、浓度和消化时间不同，可能会出现消化不足或者酶毒性损伤，从而导致细胞的数量和质量差异。因此，需要提供一种细胞得率高的软骨细胞体外分离方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法。该分离培养方法软骨细胞得率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，II型胶原酶的消化时间为16～20h。

本发明通过实验研究出一种比较好的软骨细胞原代分离方法，该方法细胞获得周期短、数量较多，获得细胞的活率也较高。

作为优选，II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％。

作为优选，II型胶原酶的消化时间为18h。

在本发明提供的实施例中，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.25％。

作为优选，胰蛋白酶的消化时间为20～30min。

优选地，胰蛋白酶的消化时间为30min。

作为优选，组织块为小于1mm³的组织块。

在本发明中，II型胶原酶进行消化后还包括细胞培养的步骤。

在本发明提供的实施例中，细胞培养的培养基为含有10％FBS和0.1μg/mL EGF的DMEM/F12培养基。

作为优选，细胞培养的细胞密度为(1～10)×10⁴个/mL。

在本发明提供的实施例中，细胞培养的细胞密度为2×10⁴个/mL。

在本发明提供的实施例中，加入胰蛋白酶进行消化与加入II型胶原酶进行消化之间还包括清洗的步骤。

在本发明提供的实施例中，清洗采用PBS清洗，清洗的次数为3次。

本发明提供了一种软骨细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括：将软骨组织处理成组织块，加入胰蛋白酶进行消化，然后加入II型胶原酶进行消化；II型胶原酶的质量百分比浓度为0.05％～0.1％，II型胶原酶的消化时间为16～20h。本发明具有的技术效果为：

本发明通过实验研究得知，采用适宜的II型胶原酶的浓度和消化时间用于软骨组织的消化，可有效维持软骨细胞的活力，使得分离得到的软骨细胞在后期的增殖培养时能够在较短时间内获得足够数量的软骨细胞，大大提高了细胞培养的效率。

具体实施方式

本发明公开了一种软骨细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的软骨细胞的分离培养方法中所用生物材料或试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：