[发明专利]一种应用CD45免疫荧光联合CEP 8探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物医学临床检测领域，具体涉及一种应用CD45免疫荧光联合CEP 8荧光原位杂交探针一步法共染鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：固定液、2×SSC、0.3％NP‑40/0.4×SSC、0.075M KCl溶液、CD45单抗和CEP 8探针混合液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂。本发明采用CD45免疫荧光抗体联合CEP 8荧光原位杂交探针鉴定捕获的循环肿瘤细胞，通过一步法完成了免疫荧光和荧光原位杂交检测，克服了免疫荧光检测和荧光原位杂交检测联合使用时存在相互干扰、检测耗时较长的问题，一步法杂交孵育在2h内快速完成，大大减少了检测时间，并且检测结果观察直观。

技术领域

本发明属于生物医学临床检测领域，具体涉及一种应用CD45免疫荧光联合CEP 8荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落释放进入外周血循环的肿瘤细胞，大部分CTCs在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶。近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果。而且分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的。更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。

CTCs富集捕获的方法基本上基于以下三种原理：免疫捕获、细胞大小、其他特征的识别(如细胞密度、电荷、形变能力等)，前两种是目前应用较多的方法。捕获后对CTCs鉴定是实现CTCs运用于临床肿瘤患者的疗效实时评估、病情实时监测、指导用药和预后判断的关键。鉴定CTCs最常用的方法主要有6种方法：(1)免疫荧光法；(2)流式细胞法；(3)荧光原位杂交法；(4)RT-PCR；(5)基因芯片法；(6)二代测序法。免疫荧光法和流式细胞法基于CTCs膜蛋白特征鉴定技术；荧光原位杂交法、RT-PCR、基因芯片法和二代测序法基于CTCs核酸特征鉴定技术。

免疫荧光是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使荧光素标记的抗体与特异的肿瘤标志物(主要包括上皮细胞角蛋白、上皮细胞膜特异性抗原等)结合，通过酶和底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。免疫荧光是检测CTCs的成熟方法之一，简便、直观并可以进行形态学分析，但其敏感性只有10⁵左右，而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性，加之镜下对结果观察和判读的主观性较强，这些都限制了免疫荧光在CTCs检测中的应用。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以用探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。荧光原位杂交技术在应用于检测CTCs染色体多倍体，基因断裂，基因融合时，由于捕获的CTCs中存在大量的血细胞背景，在荧光显微镜下，寻找目标CTCs极为困难，从而限制了FISH技术在CTCs中的应用。

发明内容