[发明专利]一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置

说明书

本发明公开一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法，包括：激光光束分成两路传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；将两路线偏振光转换为两束切向线偏振光，投射到荧光样品上发生全反射并相互干涉产生条纹结构光照明图样；收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。本发明还公开基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像装置。本发明对入射光能量利用率高，干涉条纹对比度高，可以在低入射光功率条件下实现超过衍射极限的分辨率。

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜在生命科学研究中扮演着重要角色。但是，由于衍射极限的存在，即理想点物通过光学系统所成的像是一个有限大小的弥散斑，导致普通光学显微镜的成像分辨率被限制在半波长左右，即200nm。

近年来，为了突破衍射极限，在纳米尺度观测细胞的结构和功能，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微镜技术。如基于单分子定位技术的成像方法，包括光激活定位显微镜、随机光学重构显微镜等。这类方法一般要求荧光标记密度较高，需要特异荧光染料，同时成像速度慢，难以观测分子动态运动。另一种技术是受激发射损耗显微镜，该技术通过调制点扩散函数实现了超分辨显微成像。但是这类技术也要求荧光标记密度较高，需要特异荧光染料，同时入射光功率较高，会产生光漂白现象。

在超分辨显微成像中，更加常用的一种技术是结构光照明显微镜，这种技术通过在傅里叶域对图像频谱进行处理，将普通显微镜无法观测到的高频分量移动到低频范围内，从而获取了成像样品的精细结构，提高了图像分辨率。结构光照明显微镜需要获取的图像数量较少，成像速度高，适用于实时活体细胞成像；所需荧光标记密度较低，无需特异荧光染料，普通宽场荧光显微镜所使用的荧光样品都可用于结构光成像，扩展了其应用范围，方便多色成像；入射光功率低，对生物体损伤小。但与上述几种方法相比，结构光照明显微镜的分辨率相对较低，只有100nm左右。虽对入射光功率的要求较低，但由于图像处理需要光栅扫描，限制了成像速度的进一步提高。

发明内容

本发明提供了一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法和装置，利用全内反射产生的倏逝波干涉产生结构光图样，进一步提高了普通结构光照明显微术的分辨率。该种方法和装置简单，操作方便；入射光能量利用率高；成像速度快；干涉条纹对比度高；可以在低入射光功率条件下实现超过衍射极限的分辨率，特别适用于生命科学领域中对荧光样品进行成像。

为实现上述的发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于全内反射结构光照明的宽场超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)激光光束分成两路传播方向对称且振动方向垂直的线偏振光；

2)将两路线偏振光转换为两束切向线偏振光，投射到荧光样品上发生全反射并相互干涉产生条纹结构光照明图样；

3)收集样品发出的荧光信号，得到荧光强度信息；

4)依次旋转结构光照明图样的干涉条纹的方向，在各方向下多次改变干涉条纹的相位，得到各方向的对应相位下的多幅荧光强度图像；

5)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

在步骤4)中，至少在三个角度下旋转干涉条纹的方向，在各方向下至少三次改变干涉条纹的相位。