[发明专利]用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，特别是涉及一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法。

背景技术

SETD3是一个具有经典SET保守结构(Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste以及Trithorax)的一个甲基化转移酶。SETD3自身还包含有一个称为Rubis-subs-bind的结构域。SETD3首次被发现是因为其转录本水平在喂食过程中被调控。研究发现，斑马鱼中的SETD3具有对组蛋白H3K36位残基的单、双、三甲基化功能以及通过诱导caspase-3的激活进而抑制细胞生存能力的功能。最近的研究显示，鼠源的SETD3可以通过结合在肌生因子myogenin的启动子处来诱导肌肉细胞的分化过程，因此鼠源的SETD3在此处扮演了转录因子的角色，相对应的，鼠源的SETD3被证明具有组蛋白H3K4和H3K36位的甲基化转移酶活性。人源的SETD3蛋白被发现可以跟很多蛋白质发生相互作用，其中可以甲基化转录因子FoxM1。两者的结合可以抑制VEGF的转录。

鉴于SETD3蛋白的多种功能，研究该蛋白的重要工具——抗体的优劣决定了实验结果的可靠性。目前商品化的SETD3兔多克隆抗体有Abcam(ab177582),abcam(ab200950)，Sigma(HPA003639)，Thermo fisher(PA5-43675)，Atlas(HPA003591)；鼠单克隆抗体有Thermo Fisher(730058)。这些抗体除了Atlas抗体显示可以用于免疫荧光外，其他抗体都只能用于Western blot实验。但是Atlas抗体的效价不高，稀释比例均大于1:1000。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法。

本发明的技术方案如下：一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法，包括以下步骤：

a)用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子并提取被免疫兔子的血清；

b)用Affi-Gel偶联的GST标签的全长SETD3蛋白纯化兔子的血清。

优选地，用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子时间为：主注射、主注射后的第28天、主注射后的第42天、主注射后的第60天、主注射后的第78天。

优选地，免疫主注射后的第102天提取被免疫兔子的血清。

优选地，主注射0.5mg抗原、主注射后的第28天注射0.6mg抗原、主注射后的第42天注射0.6mg抗原、主注射后的第60天注射0.4mg抗原、主注射后的第78天注射0.4mg抗原。

优选地，N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白为经镍柱树脂纯化后蛋白。

优选地，用Affi-Gel偶联GST标签的全长SETD3蛋白步骤包括：

c)用谷胱甘肽树脂纯化GST标签的全长SETD3蛋白；

d)将GST标签纯化的SETD3蛋白透析两次,将透析后GST标签纯化的SETD3蛋白蛋白质与事先用冷水平衡的Affi-Gel 15树脂在4摄氏度下偶联十二小时；

e)用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子；

f)用柠檬酸钠溶液清洗柱子并用该溶液平衡Affi-Gel柱子；

g)将平衡后Affi-Gel柱子与庚二亚氨酸二甲酯在室温下反应30分钟；

h)用Tris-HCl溶液终止反应2小时后，并用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。

优选地，加入兔子的血清到Affi-Gel柱子上，并与Affi-Gel柱子在4摄氏度孵育十二小时。

优选地，用TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子，用Glycine溶液洗脱结合的抗体，收集的抗体用Tris-HCl溶液中和洗脱液。

优选地，测定所收集抗体的浓度，并浓缩抗体到1mg/ml的浓度，用PBS溶液透析浓缩的抗体十二小时后，在其中加入10％的甘油，分装后零下80摄氏度保存。

优选地，N端6xHis标签的全长SETD3和GST标签的全长人源SETD3蛋白均为克隆基因，并在大肠杆菌中进行表达。

本发明的有益效果是：本发明的SETD3抗体可用于免疫印迹(WB)、免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)、以及免疫沉淀(IP)多种用途，且效价和特异性较高。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

附图说明

图1是检测本发明优选实施例兔源SETD3抗体特异性的分析图；