[发明专利]用于检测副猪嗜血杆菌的LAMP引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测副猪嗜血杆菌的LAMP引物、试剂盒及检测方法，属于病原微生物检测技术领域。本发明根据GenBank登录号为CP015099的副猪嗜血杆菌的脂多糖组蛋白基因的6个不同区域设计LAMP引物，与常规PCR仅针对2个区域设计的引物相比特异性显著提高。本发明中副猪嗜血杆菌LAMP检测方法具有操作简单、结果易判断、检测时间快、灵敏度高等优点。普通PCR检测从样品DNA提取到获得检测结果，整个过程至少5h，而本发明中LAMP检测可在2h内完成。尤其当采用直接目测法判定样品感染状况时，整个操作过程仅需要恒温水浴锅、微量移液器等简单小型设备，不需要电泳，在可见光下即可准确辨别结果。

技术领域

本发明涉及一种用于检测副猪嗜血杆菌的LAMP引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法，属于病原微生物检测技术领域。

背景技术

副猪嗜血杆菌是存在于正常猪上呼吸道中的一种机会致病菌，在特定条件下能够侵入机体引发以纤维素性多发性关节炎、脑膜炎和浆膜炎为主要特征的疾病。随着我国规模化养殖的推广，养殖密度越来越大，对环境的控制要求却越来越低。目前，由于环境问题导致的副猪嗜血杆菌病已成为我国中小猪场普遍发生的一种疫病，对养殖业造成了极其严重的危害。特别是2006年高热病发生以后，副猪嗜血杆菌病的继发感染更加加重了发病猪群的病情，导致仔猪死淘率高达50％以上。副猪嗜血杆菌已成为患病猪群最重要的继发病原之一。所以，副猪嗜血杆菌病的快速检测与防控是一个亟待解决的问题。

目前，副猪嗜血杆菌的检测方法主要有病原的形态学鉴定、生理生化鉴定、血清学鉴定以及分子生物学鉴定等。病原的形态学鉴定主要是通过对病料中的副猪嗜血杆菌进行分离培养和显微形态学观察，但是副猪嗜血杆菌对外界环境的耐受性较差，很难培养，所以在临床上通过分离培养菌株进行检测的成功率很低。病原的生理生化鉴定要在成功分离了疑似菌株后方可进行，但是试验结果往往存在较大的差异性，很难精准地鉴定菌株。血清学鉴定是检测病原较常用的一种方法，但是副猪嗜血杆菌与流感嗜血杆菌、胸膜肺炎放线菌、志贺菌、沙门菌、巴氏杆菌和李斯特杆菌等存在交叉免疫反应，所以血清学鉴定结果并不理想。分子生物学鉴定是通过检测副猪嗜血杆菌的某段基因进行结果判定的，一般情况下，只要保证引物的特异性就能准确鉴别副猪嗜血杆菌。但是该方法只适用于实验室条件下的检测，因为它需要特殊的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，而这在一般的基层猪场和门诊是不具备的，并且要操作这些仪器还需要具备较高的专业技术知识。所以在临床上急需一种快速简便的检测方法。

目前，LAMP技术已用于鼠伤寒沙门氏菌、肺炎支原体、猪传染性胸膜肺炎、肠球菌、葡萄球菌、猪细小病毒、汉坦病毒等多种细菌或病毒的检测，但是对副猪嗜血杆菌检测的应用仍较少。公布号CN103205494A的发明专利公开了一种检测副猪嗜血杆菌的LAMP方法，该方法以副猪嗜血杆菌的转录起始因子(Translation initiation factor 2，infB)基因序列为靶基因设计合成引物(外引物F3/B3和内引物FIP/BIP)，由于该基因在种属间的变异率低且兼顾不同血清型之间的保守序列，因此可作为通用性基因来检测副猪嗜血杆菌，所以该方法也不能区分不同血清型或致病性与非致病性的副猪嗜血杆菌。公布号CN102776283A的发明专利公开了一种用于检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒，包括参照副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白基因(palA)的保守区设计的内侧引物对(FIP/BIP)、外侧引物对(F3/B3)和环形引物对(LF/LB)，通过对样品的总DNA进行环介导等温扩增反应，可在显色后直接检视判断样品中是否含有副猪嗜血杆菌，或者显色后在紫外光照射下进行判断，亦或通过核酸电泳的方法判断。该方法提供了一种基于副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白基因的检测方法，但是不同血清型的副猪嗜血杆菌的肽聚糖相关脂蛋白基因存在一定的差异，因此该方法在检测副猪嗜血杆菌时可能会出现漏检。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测副猪嗜血杆菌的LAMP引物，该引物基于脂多糖组蛋白基因设计合成。

同时，本发明还提供一种包含上述引物的试剂盒。