[发明专利]一种快速测定饲料添加剂中6种大豆异黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，更具体地讲，是关于一种快速测定饲料添加剂中6种大豆异黄酮的方法。

背景技术

目前，大豆异黄酮作为一种新型高效绿饲料添加剂开始广泛应用于畜禽业，有剂量小，见效快，无毒性等优点。作为一种植物雌激素，它与哺乳动物雌激素结构相似，具有类雌激素作用。在畜禽饲料中添加适量的大豆异黄酮，能够增强动物机体免疫力、提高动物繁殖能力和泌乳能力、提高家禽的产蛋性能以及促进生长等生理作用，降低饲料成本。然而，异黄酮类化合物在畜禽饲料中的添加剂量，使用时期及方法会影响畜禽的生理功能甚至引起副作用。由于饲料的主要原料——大豆和豆粕本身含有异黄酮类物质，饲料中异黄酮的含量会直接影响到其添加剂量。因此在使用异黄酮饲料添加剂时应参考饲料的配方和选料，并根据其所起的生物学功能以及动物的种类、性别和生长期的不同酌情添加，以减少其潜在的副作用。为了使大豆异黄酮更好地发挥生物学功能，需要建立检测饲料中大豆异黄酮主要成分含量的快速分析方法。

HPLC法具有快速、分离效果好、重复性好、准确度高、以及仪器自动化程度高等优点，已被广泛应用于大豆异黄酮主要成分含量的的分析检测。饲料中大豆异黄酮含量检测的研究进展缓慢，相关报道较少。

提供一种方法快速检测饲料中大豆异黄酮不同组分含量的有效方法，以便更好地为畜禽生产提供指导作用，是目前亟待解决的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，申请人经过多次实践改进，设计了一种快速测定饲料添加剂中6种大豆异黄酮的方法，利用HPLC法进行测定，具有快速准确，重复性好的优点，大大节约了测定饲料添加剂产品中6种大豆异黄酮含量的时间。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种快速测定饲料添加剂中6种大豆异黄酮的方法，所述6种大豆异黄酮分别为大豆苷(Daidzin)、黄豆黄苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、黄豆黄素(Glycitein)和染料木素(Genistein)。

按照下述步骤进行：

A、选择6种大豆异黄酮的标准品如下：黄豆黄素、黄豆黄苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素及染料木苷的标准品，本发明中所使用的6种大豆异黄酮的标准品购自上海同田生物技术有限公司。

B、标准品配制：分别称取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素6种标准品各5mg，4mg，5mg，5mg，4mg，5mg，精确到0.01mg，6种标准品中分别加80％乙醇溶解定容至50mL，100mL，50mL，50mL，100mL和50mL，分别配制成浓度为100mg/L，40mg/L，100mg/L,100mg/L，40mg/L和100mg/L作为标准品母液。

C、从步骤B中得到的6种标准品母液中分别称取大豆苷母液1mL、黄豆黄苷母液2mL、染料木苷母液1mL、大豆苷元母液1mL、黄豆黄素母液2mL和染料木素母液1mL配制成混标，浓度分别为12.5mg/L，10mg/L，12.5mg/L，12.5mg/L，10mg/L和12.5mg/L，作为标准品溶液，供上机用。

样品前处理：精密称定大豆异黄酮供试品0.1g，精确到0.0001g，加入80％乙醇约80mL，超声波加热助溶30min，冷却后再用80％乙醇定容在100mL容量瓶中，取部分混匀后的溶液，以4000r/min离心5min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤即为待测样品，等待进样，同一样品测两次平行。

色谱条件：色谱柱：Athena—C18(4.6*150mm,5μm)，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为0.1％乙酸乙腈溶液，流动相采用梯度洗脱程序：0min：90％A+10％B；12.5min：70％A+30％B；17.5min：60％A+40％B；18.5min：100％B；21min：100％B；22.5min：90％A+10％B；26.5min：90％A+10％B；30min：90％A+10％B；流速1mL/min，柱温40℃，紫外检测波长254nm；进样量10μL，运行时间30min。

通过外标法进行计算，即可得出样品溶液中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的含量。

本发明应用于动物饲料添加剂产品中6种大豆异黄酮的检测。

有益效果：本发明与现有技术相比，其有益效果是：