[发明专利]一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用

说明书

一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用，涉及一种生物医药偶联物及其制备方法并应用，本发明通过细胞穿膜肽介导胰岛素的口服吸收，提高生物利用度。本发明所述的细胞穿膜肽（CPPs），是穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）、多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）、穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种。本发明所需的穿膜肽是通过固相合成的方法得到的，并与胰岛素通过交联剂共价连接得到偶联物。本发明还提供了偶联物在治疗糖尿病方面的应用。

技术领域

本发明涉及一种生物医药偶联物及其制备方法并应用，特别是涉及一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用。

背景技术

胰岛素是临床治疗糖尿病的首选药物，以皮下注射为主。频繁地注射胰岛素不仅给患者带来极大痛苦，还可能导致皮下脂肪萎缩、外周高胰岛素引起的高血压和动脉粥样硬化等。口服胰岛素是一种理想的给药方式，不仅患者顺应性好，而且模仿胰岛素的生理途径，减少副作用产生。然而，一般情况下由于药物的分子尺寸较大以及化学稳定性较差导致直接口服胰岛素的生物利用度很低。

目前，关于改善胰岛素口服吸收的研究有很多，包括将胰岛素装载入纳米载体（Eur. J. Pharm.Biopharm. 2009, 73:25-33.）或互穿式水凝胶（Biomaterials. 2010,31:3347-56），或者用肠溶材料包衣（Biomaterials. 2010, 31:3384-94.），以及联合酶抑制剂（Biomaterials. 2012, 33:2801-11.）等。理论上，这些策略可以减少药物被消化酶降解，打开肠道上皮细胞的紧密连接，大大促进药物的跨膜吸收。然而事实上，胰岛素的口服生物利用度还远远达不到理想程度。最主要的问题还是出在药物的跨膜吸收与递送这一步，如何高效安全地促进药物的跨膜转运成为研究的重点。

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，为大分子药物跨膜吸收提供了一条新途径。其穿膜作用不依赖经典的胞吞作用，具有细胞膜亲和性高、穿膜速度快、可迅速被降解等优势。此外，它们有一些共性：具有静正电荷和两亲性；具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子质量大100倍的外源性大分子进入细胞；可以携带多种活性物质进入细胞，导入近乎所有的细胞；可以通过固相合成或原核表达制备，方法成熟简便。由于细胞穿膜肽具有很强的跨膜转运能力，无刺激性，并且在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用，因此作为一种新型的药物递送工具受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用，本发明用二甲基马来酸酐（DMMA）对CPPs上的氨基进行保护，使其巯基与交联剂的MAL基团反应，然后NHS基团再与INS上的氨基反应，最后脱氨基保护得偶联物。整个合成过程简单易行，不涉及剧烈条件，对于蛋白药物活性保留十分有利。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述偶联物的结构如下所示：

其中，n为15～220；INS代表胰岛素分子；CPPs代表细胞穿膜肽分子。

所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述细胞穿膜肽为穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）、多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）、穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种（端基均为半胱氨酸）。

所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述胰岛素和细胞穿膜肽是通过交联剂NHS-PEG-MAL完成的偶联。