[发明专利]一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及抗体及其制备方法技术领域，具体是一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体。

背景技术

细菌对抗生素的耐药性随着新型及广谱抗生素的广泛使用而不断发生变化，其中革兰阳性菌(Gram-positive bacteria，G+)耐药性问题尤为突出，以葡萄球菌、链球菌和肠球菌的耐药性最为常见和严重。肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁主要成分。而人、动物和植物细胞中并不含有这样的成分。因此，肽聚糖可以作为诊断是否为革兰阳性菌感染的靶标。医院内诊断革兰阳性菌，一般是通过微生物培养的方法。这要求能够获得病患处的活体组织，在很多情况下，这是不能的。例如金黄色葡萄球菌肺炎常见于新生儿和幼童，在这种情况下，组织培养的手段是不可行的。另一方面，还可能使病原菌流传开来，感染抵抗力较弱的病人。因此，开发非培养、非侵袭性的诊断方法是不仅关系到革兰阳性菌感染患者的生命，也关系到医院内其他病人的安全。其中，ELISA方法以其操作简便、灵敏度高等优点，广泛应用于临床检测和科学研究。

目前，在国内上并没有可以应用于临床的革兰阳性菌快速诊断试剂盒。我国国家药监局也没有给予任何厂家该领域市场准入证和许可证。因此，国内在该领域的研究是空白。在国际市场上，只有日本WAKO一家公司生产可以用于检测革兰阳性菌快速诊断试剂盒SLP，但仅供科研。因此，研发具有自主知识产权的肽聚糖检测试剂盒具有重要意义。而ELISA方法的关键是获取合适的抗体，双抗体夹心ELISA方法是本申请人准备研发的一种高效检测方法，该方法势必对抗体的要求很高，需要抗体之间能够较好的配对。本申请人已获取了一株具有广谱性检测革兰阳性菌的肽聚糖单克隆抗体3F8，专利号为CN102675457A。仅利用此株单克隆抗体建立检测革兰氏阳性菌的间接竞争ELISA方法，灵敏度为1ug/ml，对于人血清样本的检测具有一定的局限性，但未取得预期结果。基于双抗体夹心ELISA的高灵敏度的优点，为更高灵敏度检测人血清样本，因此，制备另一种抗体至关重要，故制备针对肽聚糖抗原的抗体成为开发该抗原检测试剂盒的关键。

多克隆抗体的优点是可以识别同一抗原的多个表位。故在免疫检测时，可识别更多的抗原，受抗原构象变化的影响较少。因此，采用多克隆抗体包被酶标板，可以捕获更多的抗原，再与特异性强的单克隆抗体结合，既提高了方法的灵敏度，也增加了方法的特异性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供一种金黄色葡萄球菌肽聚糖的多克隆抗体，为双抗体夹心ELISA方法的实现打下基础，为应用于临床的革兰氏阳性菌快速诊断试剂盒的早日上市提供保障。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种金黄色葡萄球菌肽聚糖多克隆抗体，该肽聚糖多克隆抗体通过如下方法取得：

一、免疫动物

(1)以与单克隆抗体3F8相同免疫原的金黄色葡萄球菌肽聚糖作为免疫原，免疫新西兰家兔；具体方法为：

①新西兰家兔，筛选条件为：雄性，单重在2.5kg-3.0kg之间；

②首次免疫剂量为500ug糖/只，佐剂为弗氏完全佐剂，与二次免疫间隔时间为3周；

③二次免疫免疫剂量为250ug糖/只，佐剂为弗氏不完全佐剂，与三次免疫间隔时间为2周；

④三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第六次免疫；

二、多克隆抗体的获得

(1)效价测定：免疫过程中，从第三免以后，每次免疫后7天采血测定效价，至第六免确定血清效价稳定；

(2)抗血清分离：六免后血清效价达到1：10000以上，股动脉放血收集血清样本，分装后-20℃保存；

(3)饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化

①取定量家兔血清与PBS缓冲液等体积混匀后，缓慢加入2倍家兔血清体积的饱和硫酸铵溶液，并进行4℃过夜；

②次日离心，取沉淀并用PBS缓冲液溶解，再加入与PBS缓冲液等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃透析，获得初步纯化产物；

(4)亲和层析进一步纯化得到多克隆抗体

采用GE ProteinA柱子进行亲和层析纯化，进一步纯化后得到多克隆抗体。

而且，在获得肽聚糖多克隆抗体的方法中，所述步骤(1)中的免疫具体包括：背部皮下注射免疫、腹腔注射免疫及静脉注射免疫。

而且，在获得肽聚糖多克隆抗体的方法中，所述步骤(1)中选择免疫的新西兰家兔由人工饲养的鼠、马、牛及羊替代，免疫剂量根据具体免疫动物种类，体重确定。

本发明的优点和效果是：