[发明专利]转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因作物中PAT基因的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫和抗除草剂，其中PAT基因是一种草丁膦乙酰转移酶基因，含有PAT基因的转基因作物可耐受广谱除草剂草胺膦。PAT基因已广泛应用到转基因玉米、大豆的新品种研究中，针对PAT基因开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。

LAMP技术是由日本学者于2000年开发出来的一种新的基因扩增技术，该技术的特点在于：①恒温扩增：在60~65℃的恒温条件即可完成扩增反应，不需要特殊仪器设备；②快速高效：在1 h内即可完成扩增及产物检测过程；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：在反应液中加入染色剂后，通过肉眼观察颜色变化即可判断样品中是否含有检测靶标。LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因作物检测领域具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的在于公开一种转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于公开一种转基因作物中PAT基因的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因作物中PAT基因的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

根据PAT基因的核苷酸序列，设计PAT基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~6；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。

转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组，包括外引物PAT-F3、外引物PAT-B3、内引物PAT-FIP、内引物PAT-BIP、环引物PAT-LF和环引物PAT-LB，其核苷酸序列分别为：

外引物PAT-F3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG（SEQ ID NO：1）；

外引物PAT-B3：GGTAACTGGCCTAACTGGC（SEQ ID NO：2）；

内引物PAT-FIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCCATAGGCCTTCCAAACGATCC（SEQ ID NO：3）；

内引物PAT-BIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAAGGAGGAGCTGGCAACTCA（SEQ ID NO：4）；

环引物PAT-LF：GCCTCATGCAACCTAACAGAT（SEQ ID NO：5）；

环引物PAT-LB：GCATGGTGGATGGCATGAT（SEQ ID NO：6）。

转基因作物中PAT基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的检测引物溶液，PAT-F3、PAT-B3、PAT-FIP、PAT-BIP、PAT-LF和PAT-LB的浓度依次为4~6 µmol/L、4~6 µmol/L、32~48 µmol/L、32~48 µmol/L、4~6 µmol/L和4~6 µmol/L；

（2）具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为6~10 U/μL；

（3）10×LAMP反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH₄)₂SO₄，40~100 mmol/L MgSO₄，6~14 mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料。

优选的，所述的检测引物溶液中6条引物的浓度依次为5 µmol/L、5 µmol/L、40 µmol/L、40 µmol/L、5 µmol/L和5 µmol/L。

优选的，所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8 U/μL。