[发明专利]一种病原性溶藻弧菌的检测试纸

说明书

本发明提供一种病原性溶藻弧菌快速检测试纸，其中硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线，所述的四条检测线分别是溶藻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物和全菌破碎蛋白；靠近吸水垫的质控线为羊抗兔IgG。本发明提取病原菌多种抗原蛋白特异地排列组合起来，在试纸上与待检测样品同时进行反应，并在检测线T4上特别设置了全菌破碎蛋白，解决了其他菌的共同抗原导致的免疫交叉反应干扰结果判定的问题，可以准确地区分阳性结果和交叉反应。

技术领域

本发明涉及一种水产动物病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的检测方法，同时也涉及一种溶藻弧菌快速检测试纸及其制备方法，其属于免疫学、微生物学和诊断试剂交叉技术领域。

背景技术

溶藻弧菌是革兰氏阴性嗜盐嗜温菌，广泛分布在世界各地的海水和河口处，并且其数量居海水类弧菌之首。溶藻弧菌是我国海洋中优势菌群之一，存在多种海洋动物体内，是鱼、贝、虾蟹等海水养殖动物的条件致病菌，可通过鱼、虾或贝受损表皮、黏膜、口引发感染，多在夏季发病，给水产养殖业带来巨大经济损失。另外，溶藻弧菌可导致人类多种疾病，包括感染伤口溃疡、中耳炎、外耳炎、败血症等，近年来的研究证实该菌与副溶血弧菌一样，是沿海地区腹泻病和食物中毒的常见病原菌。有效快速的检测诊断对该病的预防和控制具有重要意义。

目前常用的溶藻弧菌的检测方法有免疫酶联反应、环介导等温扩增技术(LAMP)、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR等，但这些技术在实用性上皆有一定的局限，耗时长，操作复杂，需要专业设备和技术人员，不适用于普通养殖人员在现场对溶藻弧菌的实时检测。胶体金免疫层析试纸具有易于携带、操作简便快捷、结果肉眼可见、不需要专业人员和设备、经济实用等优点，是一种十分有发展前景的即时、现场快速检测技术。

细菌是多种抗原成分组成的复合体，其抗原包括菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原和菌毛抗原等，可诱导机体产生抗体，可利用抗原-抗体特异性反应以达到检测病原的目的。但是，因分类地位相近，有些弧菌间具有的共同抗原性蛋白会导致不同弧菌之间存在交叉免疫反应性，从而对检测结果的准确判定造成干扰，因此，排除交叉反应对结果判定的影响是免疫学检测技术需要解决的关键问题。通常解决方案是通过筛选该病原菌独有的抗原或特异性抗体，但由于共同抗原的存在增加了筛选难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、特异性强的水产动物病原性溶藻弧菌快速检测试纸，其检测结果肉眼可见，不需要专业仪器设备，能够快速地对鱼类病原性溶藻弧菌进行特异性检测，并能避免检测过程中出现由免疫交叉反应导致的误差。

本发明提供的病原性溶藻弧菌快速检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设置载有金标兔抗溶藻弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线，所述的四条检测线分别是溶藻弧菌的外膜蛋白(T1)、鞭毛蛋白(T2)、胞外产物(T3)和全菌破碎蛋白(T4)；靠近吸水垫的质控线为羊抗兔IgG。

上述使用到的兔抗溶藻弧菌抗体，其制备方法如下：

将溶藻弧菌扩大培养，并将菌液浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后，分4次免疫纯种新西兰大白兔。第一次混入弗氏完全佐剂，间隔一周后加强免疫，混入弗氏不完全佐剂；最后一次于耳缘静脉注射免疫，一周后取血，分离得到血清，辛酸-硫酸铵法得到兔抗溶藻弧菌抗体。

所述用到的溶藻弧菌外膜蛋白，制备方法如下：