[发明专利]一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用

说明书

本发明公开了一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及表达方法和应用，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ分别对pET28‑a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有Hind Ⅲ和Xho Ⅰ粘性末端的luxS基因片段和pET28‑a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和载体片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a‑luxS。本发明获得的蛋白质在细菌交流介导的有益性状开发和有害性状控制的研究及应用领域具有巨大潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域技术领域，尤其涉及一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。

背景技术

细菌能够分泌自诱导因子感知周围环境中细菌的密度并调控基因表达的现象称为群体感应(quorum sensing，QS)，参与调控细菌的多种生长发育过程，如生物发光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、细菌毒力因子分泌等、与人类卫生保健、农业生产及环境保护等都有密切的关系。根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS系统主要分为3种：革兰阴性菌的AHL-LuxI/LuxR系统、革兰阳性菌中寡肽介导的双组分感应系统与呋喃硼酸二脂类化合物(AI-2)介导的AI-2/LuxS种间群体感应系统。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在种间存在广泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群体感应调控系统备受重视。研究其诱导的密度感应机制，有助于理解微生物生物学行为，并为探索治疗微生物感染提供新思路。

细菌通过种间群体感应通用信号分子AI-2实现种间信息交流，而S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)是AI-2合成途径中的关键酶。AI-2合成途径中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被作为一种甲基供体,产生的毒性中间产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)水解成S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS催化SRH裂解成DPD和高半胱氨酸，DPD自动进行分子重排生成信号分子AI-2。

乳酸菌是革兰氏阳性细菌，其中不仅有寡肽介导的双组分感应系统，而且存在AI-2/LuxS群体感应系统。乳酸菌产细菌素与对人体消化道粘附的特性有助于抑制或排挤机会致病菌，降低人体被致病菌感染的风险。研究表明乳酸菌的这些益生特性受QS系统调控。

目前市面缺少商品化的AI-2，但存在SAH。SRH可在酸性高温条件下水解，生成SRH，再经LuxS体外催化合成DPD。对于研究AI-2介导的群体感应系统的实验来说，有在体外高效的表达LuxS蛋白，继而体外合成AI-2用于考察不同实验组别的差异，能使实验结果更具有说服力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。本发明将S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因(luxS)的重组表达载体pET28a-luxS，将该表达载体导入大肠杆菌细胞内，通过诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导，完成S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达，并通过亲和纯化得到目的蛋白。

本发明第一方面，提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28-a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a-luxS。