[发明专利]牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛副流感病毒检测技术领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

牛副流感病毒(Bovine parainfluenza type-3virus，BPIV3)是能够引起牛急性呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的重要病原体之一，是单股负链RNA病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科、呼吸道病毒属的成员。1959年美国首次从牛体分离到该病毒，目前在我国各省份广泛存在，给养牛业带来巨大的经济损失。在规模化养殖厂2至6月龄犊牛感染发病率很高，死亡率低，易继发细菌感染，死亡率可达到20％以上，犊牛感染愈后再次感染症状不明显，在无临床症状的牛上也可分离到此病毒。牛副流感病是牛群的一种常发病，在牛群中较长期存在，气温骤降或长途运输等应激条件下可引起疫情暴发。

目前，主要采用ELISA、中和实验、免疫组化、血凝抑制试验检测和RT-PCR、多重PCR、LAMP等方法检测牛副流感病毒。然而，现有检测牛副流感病毒3型病毒的方法普遍存在灵敏性较低、假阳性较高的缺点，并且，现有检测方法大多数采用国外进口试剂，相比国内，国外进口试剂价格昂贵，导致检测成本增加。

纳米颗粒技术是当前研究的热点，其良好的应用前景目前被广泛应用于各个研究领域，纳米PCR技术是近年发展的一种新型PCR技术。2005年，我国学者李海阔首次报道金纳米粒子辅助的PCR方法，大大提高了PCR反应的特异性。因纳米PCR具有灵敏度高、特异性好、分析速度快、操作简便等优点，检测结果可靠，近年来在疫病临床诊断中得到了广泛运用。

发明内容

为了解决现有牛副流感病毒3型病毒检测方法存在的灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本发明提供一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，

P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有422个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)配制nano-PCR反应液

所述反应液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，

P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；

(2)建立牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒

所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。