[发明专利]牛病毒性腹泻病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛病毒性腹泻病毒的检测技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus，BVDV)是由BVDV病毒引起的传染病，是牛急性呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的重要病原体之一，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高，传染来源主要是病畜。我国养牛产业正处于快速发展期，随之牛系统性疾病与日俱增，对养牛业危害严重。牛病毒性腹泻(BVD)是各牛场首要防制的传染病之一，严重影响牛的生长发育，可以起母牛繁殖障碍，BVD感染亦可使母牛首次发情时间延迟15-42天，受孕率最高下降达70％，流产风险2.2倍以上，小牛死淘率增加3％以上，青年牛死亡率达20％以上，病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。本病呈全球性分布，各养牛业发达国家均有流行。非细胞病变型BVDV病毒感染牛可产生持续性感染(persistent infection，PI)牛，PI牛的存在导致BVD不易管理，BVD易于与其他病毒和细菌发生混合感染，正因如此给养牛业造成综合危害性更强。PI牛断奶牛平均体重与正常牛，且存活期不超过两年另外BVD还会造成免疫抑制，增加了牛感染其他疾病的几率。因此BVD防制，对养牛业健康发展意义重大。

BVD给养牛业造成综合危害性强，所以牛群中BVDV抗原的筛查对于牛场健康良性发展尤为重要，高效合理的检测技术是疫病诊断的关键。目前，用于检测BVDV临床样本中病毒的方法主要包括核酸探针杂交技术、PCR技术、ELISA及中和试验等。但是这些方法普遍存在易交叉感染、易误诊、耗时费力的问题。

发明内容

为了解决BVD感染常存在交叉感染、易误诊、现有检测方法耗时费力的问题，本发明提供一种牛病毒性腹泻病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛病毒性腹泻病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：

MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3'，

P2：5'-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3'；

所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有136个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有136个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有136个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛病毒性腹泻病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制PCR反应液

所述PCR反应液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛病毒性腹泻病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC-3'，

P2：5'-CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG-3'；

(2)建立牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒

所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒为含有136个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有136个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。

作为优选的实施方式，所述牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛病毒性腹泻病毒的NP基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为136bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到牛病毒性腹泻病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。