[发明专利]一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法

权利要求书

1.一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，其特征在于该菌株是由以下方法制备的：

1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；

2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；

3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；

4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。

2.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，其特征在于步骤2)中pBpp蛋白表达基因与Abvec载体的连接是先经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到Abvec载体上。

3.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，其特征在于步骤4)所述的电转法包括以下步骤：取重组质粒Abvec-pBpp与所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。

4.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，其特征在于步骤4)所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：

A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；

B)挑取单菌落接种于3～7ml LB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；

C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。

5.应用权利要求1所述pBpp重组蛋白表达菌株制备pBpp重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：取HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株，以二者的细胞量为1:80～1:120的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h，而后破碎细胞收集上清。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔；HEK293-T细胞与所述pBpp重组蛋白表达菌株在细胞培养板中混合后每孔中液体总体积为380～420μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。

8.一种权利要求1所述pBpp重组蛋白表达菌株的功能验证方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取小鼠，连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；

2)取pBpp重组蛋白表达菌株，以灌胃的方式对步骤1)所得的II型糖尿病模型小鼠给药，每次给药剂量为10⁵～10⁶CFU，每2天给药1次；每隔7天监测所述II型糖尿病模型小鼠的血糖变化。