[发明专利]一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物及多重实时荧光PCR方法

权利要求书

1.一种同时检测五种致病菌的引物探针组合物，其特征在于，包括序列表中SEQ IDNo.1-15的序列，其中SEQ ID No.1、2、4、5、7、8、10、11、13、14分别为引物序列invA-F、invA-R、vvhA-F、vvhA-R、ipaH-F、ipaH-R、nuc-F、nuc-R、prfA-F、prfA-R，SEQ ID No.3、6、9、12、15分别为探针序列invA-P、vvhA-P、ipaH-P、nuc-P、prfA-P；所述各探针序列的5’端均修饰有报告基团，3’端均修饰有淬灭基团；所述报告基团有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬灭基团有：TAMRA，BHQ、Eclipse；所述五种致病菌为沙门氏菌、创伤弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。

2.根据权利要求1所述的同时检测五种致病菌的引物探针组合物，其特征在于，所述SEQ IDNo.1-15的序列，应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中各序列的用量为invA-F0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM。

3.一种同时检测五种致病菌的多重实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取待检食品样本的基因组DNA，备用；

(2)、将提取的基因组DNA作为模板加入到五重实时荧光定量PCR反应体系中，所述反应体系为：Taq酶1-4U、Mg²⁺5mM、dNTP 300μM、pH8.3的Tris-HCl 100mM、KCl 500mM、invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM、模板100-200ng，补水至25μL；

(3)、将反应体系放置于荧光定量PCR仪中，反应程序为95℃25s→95℃3s，60℃25-60s，40个循环；收集PCR扩增过程中的荧光信号，若待测样本中某基因的Ct值小于36，则判断该样本含拥有该基因的致病菌；若待测样本中某基因的Ct值大于等于36，则判断该样本不含有拥有该基因的致病菌。

4.一种同时检测五种致病菌的试剂盒，其特征在于，主要包括荧光定量2×PCR mix，所述2×PCR mix包含以下组份：Taq酶2-8U、Mg²⁺10mM、dNTP 600μM、pH8.3的Tris-HCl 200mM、KCl 1000mM、invA-F 1.2μM、invA-R 1.2μM、invA-P 0.6μM、vvhA-F 0.8μM、vvhA-R 0.8μM、vvhA-P 0.6μM、ipaH-F 1.2μM、ipaH-R 1.2μM、ipaH-P 1.4μM、nuc-F 0.8μM、nuc-R 0.8μM、nuc-P 0.6μM、prfA-F 0.6μM、prfA-R 0.6μM、prfA-P 0.8μM。

5.根据权利要求4所述的同时检测五种致病菌的试剂盒，其特征在于，其使用方法为：吸取PCR mix 12.5μL，加入100-200ng DNA模板，补水至25μL组成PCR反应体系。