[发明专利]东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法

说明书

本发明涉及一种东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法，该方法包括下述步骤：取第7次继代培养的东北红豆杉细胞，在B5液态培养基中悬浮培养11～13d后进行预培养1.5～2.5d；预培养基由B₅液体培养基中加入蔗糖和二甲基亚砜混合制成；将悬浮细胞从预培养基中分离出来，在60％的玻璃化保护剂PVS4中预处理25～35min；将悬浮细胞加入预冷到0℃的100％PVS4中，并在0℃脱水35～45min后将悬浮细胞加入预冷到0℃的新鲜100％PVS4液体，然后转移到冷冻管中，投入液氮冷冻。本发明具有存活率高、所需设备简单、处理步骤方便和重复性好等优点，细胞保存长期安全稳定，成本低。

技术领域

本发明属于植物细胞低温保存技术领域，涉及一种东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法。

背景技术

随着红豆杉细胞的产业化培养不断推进，不断需要稳定的优良细胞系作为种子以保证紫杉醇产量的稳定。但在东北红豆杉悬浮细胞的不断继代过程中，容易出现积累性变异，导致细胞生长和产紫杉醇的能力下降。而建立一种保存方法将优良细胞系长期稳定地保存起来是解决上述问题的一个重要途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全稳定、存活率高、重复性好的东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法。

为了解决上述技术问题，本发明的东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存方法包括下述步骤：

步骤一、预培养：取第7次继代培养的东北红豆杉细胞，悬浮培养11～13d，之后采用预培养基进行预培养，预培养天数为1.5～2.5d；所述预培养基由B₅液体培养基中加入蔗糖和二甲基亚砜(DMSO)混合制成，混合液中蔗糖浓度为0.6～0.8mol/L，二甲基亚砜浓度为45～55g/L；

步骤二、预处理：离心处理，将悬浮细胞从预培养基中分离出来，室温下在60％的玻璃化保护剂PVS4中预处理25～35min；60％的玻璃化保护剂PVS4由含有蔗糖的B₅液体培养基与100％PVS4按40:60的体积比配制而成的混合溶液，其中蔗糖在B₅液体培养基中的浓度为0.14～0.15mol/L；

步骤三、脱水处理：离心处理，将上清液去除，然后将悬浮细胞加入预冷到0℃的100％PVS4中，并在0℃脱水35～45min。

步骤四、冷冻：将步骤三脱水处理后的悬浮细胞经过离心处理，将上清液去除，添加预冷到0℃的新鲜100％PVS4液体，转移到冷冻管中，然后旋紧冷冻管摇匀后迅速将其投入液氮中冷冻。

所述步骤一中悬浮培养时间优选12d，预培养时间优选2d，步骤二中室温下预处理时间优选30min，步骤三中脱水处理时间优选40min。

所述步骤一中悬浮培养时间优选12d，预培养时间优选1.5d，步骤二中室温下预处理时间优选35min，步骤三中脱水处理时间优选40min。

所述步骤一中悬浮培养时间优选12d，预培养时间优选1.5d，步骤二中室温下预处理时间优选30min，步骤三中脱水处理时间优选45min。

所述步骤一中悬浮培养时间优选12d，预培养时间优选2d，步骤二中室温下预处理时间优选35min，步骤三中脱水处理时间优选45min。

本发明采用玻璃化超低温保存北红豆杉细胞，综合考虑悬浮培养时间、预培养时间、预处理时间、脱水时间对玻璃化超低温保存后细胞存活率的影响，最终确定了适用于东北红豆杉悬浮细胞的玻璃化超低温保存的较优方案，具有存活率高、所需设备简单、处理步骤方便和重复性好等优点，细胞保存长期稳定、安全稳定，成本低。

具体实施方式