[发明专利]一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法

权利要求书

1.一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)挑选合适的胚胎，然后用胚胎培养液清洗2-3次去除坏卵和杂质后，置于胚胎培养液中，在25℃，无光照的恒温培养箱中进行静置培养，在显微镜下挑选来自同一亲本、正常发育比率达80％以上且发育时期一致的热带爪蟾胚胎，备用；

(2)化学品毒性对比暴露实验：

a.将待测的化学品溶于标准稀释水中，分别配制成10mg/L、30mg/L、50mg/L的待测液装入试剂瓶中，每个试剂瓶中装待测液20ml，将试剂瓶用膜封口后置于2℃冰箱避光保存，备用；

b.将挑选的热带爪蟾活体胚胎分为四组，每组10-20只，分别标记为试验组1、试验组2、试验组3、对照组，每组的热带爪蟾活体胚胎生理情况无明显差异，具有可比性；

c.将试验组的胚胎进行活体培养，然后给三组试验组中分别加入10mg/L、30mg/L、50mg/L的待测液，对照组继续使用胚胎培养液培养，然后将所述的胚胎置于多功能培养箱中进行暴露实验，光照12h，黑暗12h，24h后观察每组是否有胚胎死亡，记录死亡数据，将未死亡的胚胎取出后使用100mg/L MS-222麻醉处理后，然后固定在6％的甲醛溶液中，备用；

(3)使用解剖镜观察不同化学品浓度下胚胎的发育情况，通过显微镜照相系统获取每只胚胎的特征图像，并将试验组于对照组进行比较，从而根据每组胚胎的畸形类型及表型特征体系对应的畸形系数来判断化学品的毒性程度。

2.如权利要求1所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的挑选合适的胚胎是指挑选实验室养殖的性成熟的热带爪蟾多对，热带爪蟾的各项生命体征正常，采用人工注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)的方法诱导产卵，每只爪蟾都进行两次注射，初次注射20IU，36小时后，再次注射给雌性爪蟾注射130-150IU单位，雄性爪蟾注射100-120IU，从热带爪蟾的背部注射，注射完成后将雌雄个体进行配对，待蛙抱对产卵结束后收集胚胎即可。

3.如权利要求1所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的胚胎胚胎培养液的制备方法为：给300ml的pH为7-8的弱碱性的人工合成输卵管液中加入100IU/mL的青霉素3-5ml、100μg/ml的链霉素1-3ml及10-15mg/ml的血清白蛋白20-30mg，震荡摇匀充分溶解后加入人工合成输卵管液定容至500ml，再给定容后的溶液中加入10mM NaCl 60ml、15mM KCl 50ml、5-10μg/ml的植物多糖10ml，搅拌均匀，经0.22μm过滤器过滤除菌，3-5℃温度条件下储存，即得到所述的胚胎培养液。

4.如权利要求1所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的胚胎活体培养是指将每组的五只热带爪蟾活体胚胎和50ml的胚胎培养液置于玻璃培养皿中，放入恒温培养箱中，温度控制在20-25℃，24小时后更换胚胎培养液一次，连续培养48小时后，观察热带爪蟾胚胎的生理活性，取出死亡的胚胎，备用。

5.如权利要求1所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的畸形类型是指主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形。

6.如权利要求1-5所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的畸形类型及表型特征体系是通过实验过程得到不同浓度的化学品污染的胚胎生育的畸形数据，并对畸形类型进行统计，主要表现为：眼睛畸形、泄殖腔畸形、鳍畸形、尾巴畸形、皮肤色素畸形；然后根据畸形表型特征统计建立对应的畸形程度分级，从而根据对应的化学品浓度数据建立毒性分级体系对应不同毒性浓度的畸形系数，，确定所测化学品的对热带爪蟾的发育毒性强度。

7.如权利要求1-6所述的一种利用热带爪蟾胚胎测定化学品发育毒性的方法，其特征在于，所述的畸形系数是指每个热带爪蟾胚胎的所有畸形部位的畸形程度分级的总和。